Caracterização da automontagem reversível dependente de pH de colóides de ouro revestidos com beta-amiloide 1-40

Resumo

Aqui, apresentamos um método sistemático que descreve a automontagem quase reversível dos agregados de ouro de 20 nm revestidos com beta amilóide 1-40 (Aβ _1-40). A rede quase reversível dependente do tamanho nanométrico entre os peptídeos foi correlacionada com aminoácidos específicos ou seções do monômero Aβ _1-40.

Resumo

A caracterização de Aβ _1-40 revestida sobre as superfícies de partículas coloidais de nano-ouro foi conduzida usando espectroscopia de ressonância plasmônica de superfície (SPR) e microscopia eletrônica de transmissão (MET). O deslocamento dependente do pH observado da banda SPR de partículas de ouro de 20 nm revestidas com Aβ _1-40 foi correlacionado com a alternância de agregação e desagregação observada nas imagens MET. Um pH de ~ 4 induziu uma conformação desdobrada, e um pH de ~ 10 induziu uma conformação dobrada de Aβ _1-40 na superfície do ouro. Este processo de agregação reversível foi observado por imagem Raman à medida que o pH foi gradualmente alterado de pH 4 para pH 10. Observamos uma mudança morfológica dependente do pH em Aβ _1-40 na superfície do ouro, onde agregados claros foram observados em pH 4. No entanto, observamos diferenças muito sutis no espectro de espectroscopia Raman aprimorada por superfície (SERS) entre as condições de pH 4 e pH 10, com a diferença mais marcante sendo a densidade espectral na região de 250 ^cm-1 e 1750 ^cm-1. Especificamente, a análise do modo da agregação reversível indicou que os agregados foram formados pela conformação desdobrada de Aβ _1-40 que envolveu a seção do anel benzênico de tirosina e fenilalanina. Por outro lado, a desmontagem dos agregados foi associada a mudanças conformacionais no dobramento de proteínas de Aβ _1-40 envolvendo histidina, glutamina, metionina e ácido aspártico.

Introdução

A fibrilogênese dos peptídeos beta-amiloides 1-40 (Aβ _1-40) ou 1-42 (Aβ _1-42) tem sido extensivamente investigada como um componente crítico na formação de placas amiloides que são uma causa da doença de Alzheimer 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ^,11. O mecanismo-chave na fibrilogênese é uma oligomerização dos peptídeos Aβ _1-40 ou Aβ _1-42 para formar um agregado proteico neurotóxico, e uma extensa investigação foi conduzida para entender os mecanismos de como os monômeros formam os oligômeros 12,13,14. Empreendemos uma abordagem de examinar peptídeos amiloidogênicos formando agregados sobre uma superfície de nano-ouro e identificando fatores responsáveis pela rede entre peptídeos que estão longe da superfície do ouro 15,16,17,18,19,20,21,22.

Aβ _1-40 adota uma conformação desdobrada (A) sob condições ácidas (pH ~ 4) e uma conformação dobrada (B) sob condições básicas (pH ~ 10). Observamos partículas coloidais de ouro revestidas com Aβ _1-40 dispersas em pH ~ 10 e grandes agregados colóides de ouro revestidos com Aβ _1-40 em pH ~ 4 (Figura 1) ^{23 , 24} . A conformação desdobrada de Aβ _1-40, em condições ácidas, favorece a rede peptídica entre os monômeros Aβ _1-40 sobre a superfície de nanopartículas de ouro, resultando na formação de agregados coloidais de ouro (ver A na Figura 1). Quando o monômero Aβ _1-40 mantém a conformação dobrada em um pH básico ou neutro, Aβ _1-40, os monômeros não se conectam em agregados e as nanopartículas de ouro revestidas permanecem como partículas dispersas individuais (ver B na Figura 1). Podemos, portanto, interrogar o processo de como os peptídeos Aβ _1-40 sofrem mudanças conformacionais na rede e formam agregados, medindo o deslocamento da banda SPR em uma faixa de condições de pH 25,26,27,28,29,30,31.

Testamos vários tamanhos diferentes de nanopartículas de ouro e descobrimos que o colóide de ouro de 20 nm exibiu o processo de automontagem reversível mais proeminente de monômeros Aβ _1-40 em resposta a uma mudança externa no pH (Figura 2). Esta é uma indicação clara de uma mudança reversível na conformação do peptídeo, onde as condições ácidas (A) induzem uma conformação desdobrada, aumentando a rede e levando à agregação de colóides de ouro. A condição básica (B) foi encontrada para induzir uma conformação dobrada de monômeros 26,27,28,29,30,31.

Protocolo

1. Preparação de nanopartículas de ouro revestidas com Aβ _1-40

1. Adicione um volume de 1 mL de água destilada deionizada a 1 mg de Aβ _1-40 liofilizado (MW: 4,2 kDa, 98% de pureza de HPLC) usando uma agulha de seringa. Misture a solução com um misturador de vórtice por aproximadamente 30 s e certifique-se de que nenhuma partícula sólida seja observada na solução à temperatura ambiente (RT; ~ 20 ° C).
   1. Prepare todas as soluções de estoque usando água desionizada e destilada (~ 18 MΩ · cm).
   2. Identifique espectroscopicamente a concentração usando a absorção de tirosina a 275 nm³², que tem um coeficiente de extinção molecular ε₂₇₅ de 1390 ^cm-1 · ^M-1.
   3. Armazenar soluções de estoque de Aβ _1-40 a -80 °C. (Ver Tabela de Materiais para os produtos comerciais Aβ _1-40.)
2. Descongele a solução estoque de peptídeos aproximadamente 5 minutos antes da coleta de dados. Misture um volume de 8 μL da solução peptídica com 800 μL de partículas coloidais de ouro em um tubo de centrífuga de 15 mL. Adicione um volume de 4,2 mL de água destilada deionizada e, em seguida, vortex a amostra por 10 s 30,31,33,34.
3. Fixe a concentração de peptídeos Aβ _1-40 em 1,8 nmol e varie a proporção de peptídeos Aβ _1-40. O número de colóides de ouro variou entre ~500:1 a ~2000:1²⁵.

2. Mudança de pH iterativa e monitoramento do deslocamento de banda SPR correspondente

1. Defina a temperatura da solução em um determinado valor (por exemplo, 25 ° C) usando a unidade de controle de temperatura do espectrofotômetro ultravioleta-visível-infravermelho próximo (UV-Vis-NIR).
2. Monitore o pH inicial da solução de amostra usando um medidor de pH e ajuste-o ligeiramente abaixo do pH 7. Coletar o espectro de absorção na faixa entre 400 nm e 1000 nm.
3. Altere o pH da amostra para ~pH 4 (ou seja, pH 4,0 ± 0,3) adicionando volumes de 10 μL de HCl 0,1 M e colete o espectro de absorção entre 400 nm e 1000 nm.
4. Altere o pH da amostra para ~pH 10 (ou seja, pH 10 ± 0,3) adicionando volumes de 10 μL de NaOH 0,1 M e colete o espectro de absorção entre 400 nm e 1000 nm.
5. Alterar o pH entre pH 4 e pH 10 com HCl e NaOH 10 vezes e recolher continuamente o espectro de absorção a 25 ± 0,2 °C^29,30.
   NOTA: Para todas as soluções de amostra, a densidade óptica do pico da banda SPR foi mantida em torno de 0,2. Espera-se um efeito tampão devido à solução tampão residual em uma solução. Assim, o valor final do pH foi determinado após a confirmação do equilíbrio. O valor do pH foi medido diretamente em uma célula de cubeta de amostra usando um microeletrodo de pH, que tem uma precisão de ±0,005 pH.
6. Obtenha o conjunto de dados de comprimentos de onda do código padrão americano para intercâmbio de informações (ASCII) em função da absorbância. Extraia a posição média dos picos da banda usando o programa Peak Fit .
   1. Plote o conjunto de dados para visualizar a densidade óptica em função do comprimento de onda (nm) usando a função Plot .
   2. Marque os comprimentos de onda de pico iniciais λ₁, λ₂ e λ₃ selecionando suas posições aproximadas nos dados plotados e ajuste os dados usando a função RUN .
   3. Obtenha o gráfico contendo o pico central de cada (λ_i), XC_i, com a área de cada banda (A_i).
7. Exporte as posições e áreas de pico extraídas para um programa de planilha e calcule a posição média de pico em um determinado pH.
   1. Determine o fator de ponderação a_i de cada centro de pico λ_i comparando a área da banda (A_i) com a área total de todas as bandas como: .
   2. Extrair a posição média do pico (pH) utilizando a Eqn. (1).
      (1)
8. Gere um gráfico de reversibilidade usando o seguinte processo:
   1. Tabule as posições médias de pico, , em função de cada número de "operação", n como vs. n. Faça com que o número da operação, n, seja 1 para a amostra antes da adição de ácido a ~ pH 7. Aumente o número de operação em 1 de cada vez, alterando o pH para ~pH4 com HCl ou pH para ~pH 10 com NaOH. Faça n ser par em uma condição ácida (ou seja, ~ pH 4) e ímpar para ser uma condição básica (ou seja, pH 10).
   2. Analise a posição de pico em cada n, (n) = λ(n), usando a fórmula³⁰
      (2)
      NOTA: Represente uma posição de pico média inicial em n = 1 por A. Expresse os parâmetros B e C como o deslocamento da posição de pico dependente de n. Faça o parâmetro D como uma amplitude do fator de amortecimento, E, de repetição. Use a função seno para mostrar a ondulação da posição do pico em função de n.
   3. Transporte o conjunto de dados de (x, y) para o software Origin e plote.
   4. Forme a função personalizada dada na Eqn. (2) em Função de análise de ajuste de curva não linear. Digite os valores iniciais de A, B, C, D e E e clique em EXECUTAR para concluir o ajuste.
9. Imagem TEM
   1. Faça as amostras MET dos colóides de ouro de 20 nm revestidos com Aβ _1-40 com grades de cobre revestidas com Formvar. Examinar as amostras com um MET operado a 80 kV.
   2. Colete imagens com uma ampliação nominal de 28.000x ou 71.000x em uma câmera digital CCD (AMT) modelo XR-40 de 4 megapixels. Colete as imagens TEM para ouro de 20 nm revestido com Aβ _1-40 em cada número de operação n = 1 (~pH 7), n = 2, 4, 6, 8 e 10 (pH 4) e n = 3, 5, 7 e 9 (pH 10).

3. Imagem Raman e investigação da agregação reversível

1. Colocar 100 μL de solução num disco de mica (diâmetro de 1 cm) para cada amostra no número de operação n. Secar as amostras durante a noite antes da medição.
2. Colete imagens de luz branca em cada número de operação n. Prepare a amostra separada em um disco de mica, pois o pH foi continuamente alterado entre ~ pH 4 e ~ pH 10 para cada número de operação n (Figura 3).
3. Colete a imagem Raman em cada número de operação n com um laser de comprimento de onda de λ = 633 nm a 0,5 ± potência de 0,05 mW com resolução espacial de ~ 0,43 μm em uma grade composta por 100 × 100 pixels com um tempo de integração de 500 ms / espectro para a região entre ~ 200 ^cm-1 e ~ 2.800 ^cm-1 (Figura 4).
4. Plote o espectro representativo para cada n alinhado em função de n e construa o espectro SERS tridimensional em função de n para Aβ_1-40 revestido de ouro de 20 nm (Figura 5A). Utilize a vista superior do espectro SERS tridimensional como um mapa de contorno (Figura 5B) para extrair os modos específicos associados a uma condição de pH específica (ou seja, ~ pH 4 e ~ pH 10). Extraia quaisquer características espectrais aprimoradas para apenas n_par ou apenas n_ímpar.

Resultados

Com a fixação de Aβ _1-40 na superfície das partículas nanocoloidais de ouro, a banda SPR em torno do máximo de absorção de 530 nm mudou significativamente para a posição de pico de ~ 650 nm quando a solução se tornou mais ácida (pH 4) ³⁵ . Juntamente com as imagens TEM, identificamos que as características espectroscópicas observadas em pH 4 correspondem à formação dos agregados coloidais de ouro com conformação plausivelmente desdobrada e rede com os monômeros Aβ _1-40 desdobrados circundantes adsorvidos sobre a superfície do ouro³⁰. Observamos que os monômeros Aβ _1-40 revertem para a conformação dobrada em condições básicas (pH 10), resultando em uma deformação dos agregados de maneira quase reversível. Esse processo quase reversível ficou evidente a partir da alternância do pico médio da banda ((n)), que mudou entre um comprimento de onda mais curto e mais longo, e a morfologia dispersa versus agregada em imagens MET entre condições básicas (pH = 10) e ácidas (pH = 4). Foi observado anteriormente que uma porção do monômero Aβ _1-40 permanece desdobrada mesmo depois que a solução foi revertida para as condições básicas³⁶. O vídeo 1 mostra a mudança de cor dependente do pH do colóide de ouro nu Aβ _1-40 e 20 nm.

Como comparação, foi realizada a investigação do pH do salto do colóide de ouro nu de 20 nm (Figura 5C e D). À medida que a operação de mudança de pH prosseguiu, ela mostrou o crescimento da clusterização dos colóides de ouro em imagens de banda SPR, imagens TEM, bem como imagens de luz branca. Curiosamente, havia várias linhas espectrais SERS dependendo de n_ímpar e n_par. Por exemplo, em n_par (pH ~ 4), a linha a 275 ^cm-1, que foi atribuída como a moda associada a Au_n (n = 5, 6, 12, 16, 20, 58)³⁷ ou modo de Au-Cl-ligante ³⁸ foi intensamente observada. Por outro lado, para n_par, a 1008 ^cm-1 C-N str foi observado³⁹ e CH₂ wag³⁹, deformação CH₂ ⁴⁰ foram extensivamente observados a 1291 ^cm-1.

Em contraste com a morfologia de agregação clara e reversível dependente do pH observada pela imagem de luz branca, houve diferenças relativamente sutis nas características espectrais no espectro SERS entre n_ímpar e n_par. Como primeira aproximação, a densidade de linhas espectrais na região entre 250 ^cm-1 e 1750 ^cm-1 foi maior para n_ímpar do que_{n par.} As linhas espectrais na região da impressão digital, 1250 ^cm-1 e 1750 ^cm-1 (bandas de amida I, II e III) para n_ímpares , mostraram características espectrais menos resolvidas, implicando um alargamento ou aumento nas densidades espectrais. Na Figura 6, um mapa de contorno fornecido na Figura 5B (Figura 6B) foi organizado com os sinais SERS em 761 ^cm-1 (vermelho) e 1395 ^cm-1 (azul), representando as ênfases em n_ímpar e n_par, respectivamente (Figura 6C). Como um espectro SERS representativo para n_ímpar e n_par, o espectro SERS em n = 7 (vermelho) e n = 4 (azul) é mostrado na parte superior (Figura 6A). Para mostrar a correspondência com o deslocamento da banda SPR para ouro de 20 nm revestido com Aβ_1-40 , o gráfico de deslocamento da banda na Figura 3 é mostrado ao lado (Figura 6D).

Embora tenhamos dados preliminares sobre a atribuição completa do espectro SERS observado, notamos várias características notáveis de deslocamento Raman aqui. As linhas espectrais e (atribuições plausíveis) aprimoradas em n_ímpares estão principalmente na região inferior a 1000 ^cm-1: 394 ^cm-1 (Trp) 41,42,43, 761 ^cm-1 (His, Ala) 39,44,45,46,47, 875 ^cm-1 (deslocamento indol NH, alongamento CC de Met) ³⁹, 974 ^cm-1 (Glu, C-COO^- estiramento de Asp, modo associado ao citrato)39,48,49. O deslocamento Raman aprimorado em n_ainda mostrou características espectroscópicas significativas na região da impressão digital (Amida I, II e III): 1166 ^cm-1 (deformação N-H⁺ de Tyr)^39,41, 1227 ^cm-1 (Ala-Pro-Gly, Amida III)39,50,51, 1395 ^cm-1 (^COO- alongamento simétrico ou CH₂- CH₃- tesoura de Glu)^39,48, 1585 ^cm-1 (estiramento do anel CC de Phe, estiramento assimétrico do carboxilato -Au^{, estiramento} COO- do citrato, deformação do anel de benzeno)39,41,45,46,47,49,52, 1592 ^cm-1 (Phe, Tyr, C=C estiramento de Tyr, estiramento CC do anel em Phe, estiramento do anel de benzeno e COO^- alongamento em Phe e Tyr, e alongamento assimétrico de OH) ^{39 , 41 , 48 , 50 , 51} e 1628 ^cm-1 (subpico de amida I distinto para estruturas intermoleculares de folha de β⁵³, C = O e os modos vibracionais CN / NH acoplados da estrutura da proteína originada de estruturas paralelas do tipo folha de β, acúmulo de Aβ⁵⁴ agregado, bobinas aleatórias, β voltas, β grampos de cabelo⁴⁸. As sequências que aparecem para n_ímpar ou n_par são mostradas na Figura 7. No geral, para n_mesmo correspondendo à agregação reversível ou conformação desdobrada de Aβ _1-40, Phe/Tyr contendo anel benzênico, estiramento simétrico de ^COO-, CH 2- CH₃- modo de tesoura de Glu e deformação -NH⁺ de Tyr foram significativamente envolvidos na mudança conformacional do peptídeo. Durante a desmontagem da agregação que foi observada quando os peptídeos adotaram a conformação dobrada correspondente aos modos proeminentes em n_ímpares, Glu, Asp, Met, His e Ala pareciam estar envolvidos.

Figura 1: A absorbância e morfologia dependente do pH. O espectro de absorção em pH 4 (A) e pH 10 (B) para nanopartículas de ouro revestidas com Aβ _1-40 (20 nm) e as imagens TEM correspondentes, esboços de agregação/partículas dispersas e imagens de soluções em frascos são mostrados. A é a conformação desdobrada de monômeros Aβ _1-40 sob condições ácidas, e B é a conformação dobrada sob condições básicas. Diagramas de monômeros Aβ _1-40 em cada conformação e morfologias de agregação/dispersão são mostrados ao lado das imagens MET. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Reversibilidade de automontagem dependente do tamanho nanométrico. O deslocamento da posição média do pico da banda SPR, , em função do número de operação, n, para todos os tamanhos testados de partículas coloidais de ouro. Os valores aproximados de pH e o estágio correspondente dos agregados mostrados na Figura 1 também são fornecidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: e imagens TEM/luz branca em cada número de operação. O número em função da operação, n, foi plotado em conjunto para Aβ _1-40 revestido de ouro de 20 nm (círculos fechados) e colóide de ouro de 20 nm (círculos abertos) e é mostrado com imagens representativas de TEM (A e C)/luz branca (B e D) em números de operação selecionados (n = 1, 2, 3, 7 e 8 marcados por setas decodificadas) para Aβ _1-40 revestido de ouro de 20 nm (A e B) e colóide de ouro de 20 nm (C e D). A fonte preta indica pH 7, a fonte azul indica pH 4 e a fonte vermelha indica pH 10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Luz branca representativa e imagem Raman. A imagem de luz branca, imagem Raman e espectro SERS para (A) n = 2 e (B) n = 3; i) imagem de luz branca em um amplo campo de visão, ii) imagem de luz branca na área onde a imagem Raman foi coletada (rotulada por um quadrado vermelho em i)), iii) a imagem Raman de dois componentes combinados, iv) imagem Raman do componente 1 e seu v) espectro SERS de iv), vi) imagem Raman do componente 2, e vii) espectro SERS de vi). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Mapa de contorno do espectro SERS para n_ímpar, n_par e n_todos. (A) O mapa tridimensional do espectro SERS na região de 250 ^cm-1 e 1750 ^cm-1 em função de n para Aβ_1-40 revestiu ouro de 20 nm com um mapa de contorno mostrado em (B) na parte superior. (C) O mapa tridimensional do espectro SERS na região de 250 ^cm-1 e 1750 ^cm-1 em função de n para ouro de 20 nm com um mapa de contorno mostrado em (D) na parte superior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Mapa de contorno do SERS Spectrum. O mapa de contorno do espectro SERS em função de n (1-10). (A) Absorbância a 1395 ^cm-1 (azul) e 761 ^cm-1 (vermelho). (BD) O painel inferior mostra o espectro SERS e o painel direito mostra a amplitude da mudança de intensidade do sinal dos sinais SERS a cada n. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Sequências notáveis de Aβ_1-40. As sequências atribuídas a ter envolvimento significativo em n_ímpares (correspondendo à formação de conformação dobrada) são indicadas por setas vermelhas para baixo, e aquelas atribuídas a ter envolvimento significativo em n_pares (correspondendo à formação de conformação desdobrada) são indicadas por setas azuis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Mudança de cor dependente do pH do colóide de ouro nu Aβ_1-40 e 20 nm. Clique aqui para baixar este vídeo.

Discussão

Uma consideração crítica em estudos de conformação de peptídeos é a manutenção da amostra, pois as amostras se deterioram se armazenadas incorretamente. As amostras de peptídeos foram recebidas na forma liofilizada e começaram a desnaturar uma vez que foram reidratadas com água destilada deionizada, mesmo quando armazenadas a -80 °C. A pureza dos colóides de ouro foi verificada por análise de controle de qualidade. Para manter a estabilidade dos coloides, eles foram armazenados a 4 °C e não congelados. As soluções coloidais de ouro foram preparadas frescas para cada experimento porque a solução tampão de sais desestabilizaria o colóide de ouro. As soluções de HCl e NaOH foram preparadas frescas para cada experimento.

Os desafios técnicos de ler e registrar manualmente o pH da solução com instrumentos delicados enquanto alteram o pH entre 4 e 10 limitam a precisão de nossos resultados relatados. Assim, não observamos resultados consistentes na intensidade dos sinais SERS. Isso provavelmente introduziu um erro na amplitude usada para o gráfico de contorno. Trabalhos futuros para verificar os modos associados a n_par ou n_ímpar podem introduzir mutações para substituir os aminoácidos na sequência Aβ _1-40 que relatamos estar envolvidos na mudança conformacional da proteína, como os resíduos únicos de tirosina ou asparagina.

"A interação entre o monômero Aβ_1-40 e a superfície do ouro é considerada uma interação dipolo, e o nível de ligação de hidrogênio foi hipotetizado no trabalho de H. Schmidbauer et ^al.55. Em um trabalho separado, investigamos a espectroscopia SERS em função da quantidade de Aβ_1-40 sob a condição ácida, extraiu a formação de adsorção dependente do tamanho nanométrico⁵⁶. Para ouro de 20 nm, especulou-se que a ligação C = C ou -CN da histidina (His) iniciasse a adsorção; para ouro de 80 nm, no entanto, um modo de respiração do anel benzênico de fenilalanina (Phe) ou tirosina (Tyr) atingiu a superfície do ouro para iniciar a adsorção. O processo de adsorção de Aβ_1-40 sobre a superfície do ouro em condições neutras ou básicas (pH ~ 10) foi considerado para manter o colóide de ouro revestido com Aβ_1-40 como hidrofílico, uma vez que nenhum precipitado foi formado na condição aquosa. No entanto, os precipitados foram observados em pH 4, implicando que os agregados eram hidrofóbicos.

As imagens TEM e as imagens de luz branca mostram apenas indiretamente evidências da agregação. Tentamos realizar espectroscopia de dicroísmo circular (CD) para correlacionar a morfologia observada na agregação reversível com as estruturas secundárias. No entanto, as linhas de base de espalhamento nos impediram de obter sinais de CD reprodutíveis. Em vez disso, portanto, utilizamos a espectroscopia Raman, concentrando-nos mais nos modos aprimorados quando a agregação (conformação desdobrada de Aβ_1-40) ocorreu sob pH ~ 4 ou quando a desagregação (conformação desdobrada de Aβ_1-40) sob pH ~ 10. Assim, a melhor especulação para a identificação da estrutura secundária neste trabalho limitou-se ao monitoramento dos nós associados às estruturas secundárias. Isso foi demonstrado na observação da folha de β a 1628 ^cm-1, particularmente sob condição de pH 4.

Este estudo observou apenas a mudança na conformação do peptídeo para os colóides de ouro de 20 nm de diâmetro e investigou apenas n até 10. As propriedades de conformação e agregação do peptídeo Aβ _1-40 podem ser alteradas pelo tamanho da partícula que eles adsorvem a⁵⁶. Portanto, mais trabalho é necessário para entender as propriedades dos peptídeos que são baseados na rede entre monômeros e aqueles que são afetados pelas características físicas da superfície de adsorção. Nas condições que testamos, apenas os colóides de ouro de 20 nm de diâmetro exibiram reversibilidade da morfologia de agregação, e os mecanismos de como o diâmetro do colóide afeta a reversibilidade dessa propriedade não são conhecidos. Aumentar n até 20 pode fornecer mais informações sobre o grau dependente do modo da reversibilidade da morfologia de agregação. Essas investigações sobre como o tamanho do colóide de ouro afeta a agregação do peptídeo beta amilóide produzirão informações importantes sobre os mecanismos moleculares da patologia da doença de Alzheimer.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amyloid beta peptide 1-40 (Aβ1–40 peptide)	r-Peptide (Bogart, GA, USA)	A-1156-2
CCD digital camera	AMT	XR-40 4-megapixel CCD
Distilled deionized water from Milli-Q- water system	Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)	Milli-Q IQ 7000
Freezer -86 oC	Thermo Scientific	Revco Chilly Willy  RLE Series Unit ID 187004 Build Number 40.04
Gold Colloid (10 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15703-20
Gold Colloid (100 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15711-22
Gold Colloid (15 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15704-20
Gold Colloid (20 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15705-20
Gold Colloid (30 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15706-21
Gold Colloid (40 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15707-21
Gold Colloid (50 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15708-21
Gold Colloid (60 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15709-22
Gold Colloid (80 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15710-22
Highest Grade V1AFM Mica Discs 10 mm	Ted Pella Inc.	#50
Hydrochloric Acid Standard Solution, 1.0 N	Fluka	Lot# SHBB4705V     318949-2L
Macro quartz quvette Light Path 10 mm	Fire Fly Science	Type1-MC-Path10mm
Micro pH electrode	HORIBA	Model 9618S (MFG No. 9Y8E0050)
Peak Fit Program	Origin (Northampton, MA, USA)	OriginPro2018b (64-bit) b9.5.5.409 (Academic)
pH 4.00 Buffer solution	VWR	Cat No. 34170-127
pH 7.00 Buffer Solution	Fisher Chemical	SB107-4 Lot 191041
pH meter	HORIBA	Model F-72G (MFG No. B27M0017)
Pipet Tips  Maxi Tips 1–5 mL	Fisher	02-707-467
Pipet Tips 10 mL	Fisher	02-717-135
Pipet Tips 1000 mL	Fisher	02-717-156
Pipet Tips 1–200 mL	Fisher	02-717-143
Pipetter Fisher Brand Elite 0.5–5 mL	Fisher	QU05317
Pipetter Fisher Brand Elite 100–1000 mL	Fisher	QU01672
Pipetter Fisher Brand Elite 10–100 mL	Fisher	MU10985
Pipetter Fisher Brand Elite 1–10 mL	Fisher	MU08178
Sodium Hydroxide Solution 1.0 M	Fluka	Lot#05096BPV   319511-2L
TEM	FEI Co	Morgagni model 268
TempAssure PCR Tubes, Flat Caps, Natural	USA Scientific		polypropylene. 0.2 mL individual thin-wall tubes with attached frosted flat caps
UV-Vis-NIR Spectrophotometer	Varian	CARY 5000 UV1106M074
WI Tec alpha300R Confocal Raman Microscope	WITec-Oxford Instrument	XMB3000-3001