Este projecto foi apoiado pelo Centro Deshpande para a Inovação Tecnológica no MIT (RK e JMK) ea concessão de CARREIRA NSF 0952493 para RK através do programa de Química e Biológica Separações. Agradecemos ao Instituto de Nanotecnologias Soldier (ISN) ea Microsystems Technology Laboratory (MTL) no MIT para utilização de suas instalações.

1. HL60 célula rolando 1.1. Fabricação de Patterned Substratos. <ol><li> Utilizando a impressão microcontact (μCP) 4-7 para fazer alternando monocamadas auto-organizadas (SAMs) de moléculas de PEG nas lâminas de vidro revestidas de ouro: Fabricar microcontact impressão PDMS (polidimetilsiloxano) selos que definiu os padrões de receptor com ângulo de inclinação de α = 10 ° por um SU-8 processo de moldagem. Limpe a superfície de ouro com a solução de piranha (3:1 mistura de ácido sulfúrico a 30% de peróxido de hidrogênio) por 20 minutos e depois enxaguar a superfície com água abundante DI de 24,5 ° C antes do uso. Tinta do carimbo PDMS com solução de PEG 5mM em etanol. Seque o selo no ar por 20 minutos. Gentilmente colocou o selo na superfície de ouro por 40 segundos e verifique se há um bom contato entre a superfície do ouro e do carimbo. Sem excesso de pressão é necessária. Enxaguar a superfície com o etanol e seque-o sob um fluxo de N 2. </li><li> Incubar o substrato dentro da P-selectina solução (15 mg / mL em DPBS), utilizando uma câmara de perfusão (Ciências Microscopia Eletrônica) durante 3 horas a 24,5 ° C para o padrão de áreas remanescentes com a P-selectina. Enxaguar a superfície com DPBS copiosa. </li><li> Aterrar a superfície com BSA (1 mg / mL em DPBS) por 1 h para bloquear interacções não específicas. Enxaguar a superfície com DPBS copiosa. </li></ol> 1.2. Célula do Rolling Experimentos em uma Câmara de Fluxo. <ol><li> Fluxo de uma suspensão de células HL60 (~ 10 5 células / mL) sobre as superfícies estampados em uma câmara de fluxo retangular (Glycotech, Inc; largura w = 1,0 cm, comprimento = 6 cm, altura h = 0,0127 centímetros) de 24,5 ° C. Use uma bomba de seringa (Instrumentos de Precisão Mundial, SP230IW) para gerar fluxo de 75 mL / min, com tensão de cisalhamento correspondente cerca de 0,5 dyn / cm 2 (~ 0,05 Pa). Calcular tensão de cisalhamento τ usando a equação de fluxo de Poiseuille plano τ = 6μQ/wh 2, onde μ é a viscosidade cinemática (0,001002 Pa s), Q é a taxa de fluxo volumétrico, w é largura da câmara de fluxo, e h é a altura do câmara de fluxo. </li><li> Use um microscópio invertido (Nikon TE2000-U) com uma câmera montada (Andor ixon 885) para gravar as células HL60 rolando interações com adesivo P-selectina substratos usando um 4 × objetivo, normalmente a uma taxa de 1 quadro por segundo para as durações de 300 s. Realizar três experimentos independentes, para cada magnitude tensão de cisalhamento e ângulo de inclinação padrão. Apresentar dados como média e desvio padrão dos valores médios obtidos para cada experimento. </li><li> Análise de Dados. Analisar as seqüências de imagens por um programa personalizado Matlab (Mathworks, Inc.) que utilizaram uma partícula de rastreamento 8 freeware para gerar faixas ao longo das bordas da linha padronizada. Faixas estendendo até o fim de uma banda de P-selectina são selecionados e equipado com dois segmentos de reta - um alinhado com o fluxo, a outra alinhada com a borda padrão. Estes dois segmentos são então usadas para calcular o comprimento de rastreamento borda, rolando velocidade na borda, e rolando de velocidade na região simples. </li></ol> 2. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2640/2640fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura (A) mostra uma das imagens de microscopia convertido a partir do vídeo de HL60 interações rolando com adesivo P-selectina substratos usando um objetivo × 4. Regiões claras e escuras correspondem a P-selectina receptor e regiões PEG, respectivamente. Figura (B) mostra as faixas obtidas utilizando um programa Matlab personalizada. O ângulo de inclinação borda foi de 10 ° ea tensão de cisalhamento foi de 0,5 dyn / cm 2. O comprimento de rastreamento de ponta, e l, o deslocamento, d, e as velocidades de rolamento na borda e no interior das bandas, e V e V p, respectivamente, estão descritas na Figura (C-1). Figura (C-2) mostra a distribuição (o número de células gravadas) de comprimento rastreamento borda. Inserções mostram o valor médio de l e e da velocidade de rolamento na ponta (V e) e no interior das bandas (V p) no ângulo de inclinação α = 10 ° ea magnitude de estresse fluido de corte em torno de 0,5 dyn / cm 2. Barras de erro representam um desvio padrão, onde n = 3 experimentos replicar (3 superfícies replicar) para cada condição.

<ol>
	<li>Karnik, R., Hong, S., Zhang, H., Mei, Y., Anderson, D. G., Karp, J. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+control+of+cell+rolling+in+two+dimensions+through+surface+Patterning+of+receptors.">Nanomechanical control of cell rolling in two dimensions through surface Patterning of receptors.</a> Nano Lett. 8 (4), 1153-1158 (2008).</li><li>Lee, C. H., Bose, S., Van Vliet, K. J., Karp, J. M., Karnik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+Lateral+Displacement+of+HL60+Cells+Rolling+on+Asymmetric+P-selectin+Patterns.">Examining Lateral Displacement of HL60 Cells Rolling on Asymmetric P-selectin Patterns.</a> Langmuir. 27 (1), 240-249 (2011).</li><li>Norman, K. E., Moore, K. L., McEver, R. P., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+rolling+in-vivo+is+mediated+by+p-selectin+glycoprotein+ligand-1.">Leukocyte rolling in-vivo is mediated by p-selectin glycoprotein ligand-1.</a> Blood. 86 (12), 4417-4421 (1995).</li><li>Bernard, A., Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Bosshard, H. R., Biebuyck, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+patterns+of+proteins.">Printing patterns of proteins.</a> Langmuir. 14 (9), 2225-2229 (1998).</li><li>James, C. D., Davis, R. C., Kam, L., Craighead, H. G., Isaacson, M., Turner, J. N., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+protein+layers+on+solid+substrates+by+thin+stamp+microcontact+printing.">Patterned protein layers on solid substrates by thin stamp microcontact printing.</a> Langmuir. 14 (4), 741-744 (1998).</li><li>Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+self-assembled+monolayers+to+understand+the+interactions+of+man-made+surfaces+with+proteins+and+cells.">Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 25, 55-78 (1996).</li><li>Tan, J. L., Tien, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+proteins+on+mixed+self-assembled+monolayers.">Microcontact printing of proteins on mixed self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 18 (2), 519-523 (2002).</li><li>Lee, D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+Printing+of+P-Selectin+Increases+the+Rate+of+Neutrophil+Recruitment+Under+Shear+Flow.">Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow.</a> Biotechnology Progress. 24 (5), 1052-1059 .</li><li>Greenberg, A. W., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+separation+mediated+by+differential+rolling+adhesion.">Cell separation mediated by differential rolling adhesion.</a> Biotechnol. Bioeng. 73 (2), 111-124 (2001).</li><li>Higuchi, A., Tsukamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+separation+of+hepatocytes+and+fibroblasts+through+surface-modified+polyurethane+membranes.">Cell separation of hepatocytes and fibroblasts through surface-modified polyurethane membranes.</a> J. Biomed. Mater. Res. Part A. 71A (3), 470-479 (2004).</li><li>Alexeev, A., Verberg, R., Balazs, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+surfaces+segregate+compliant+microcapsules.">Patterned surfaces segregate compliant microcapsules.</a> Langmuir. 23 (3), 983-987 (2007).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós descrevemos um protocolo para examinar células trajetórias rolando no assimétrica receptor-padrão superfícies fabricados utilizando a impressão microcontact 2. As imagens do microscópio óptico da superfície modelada mostrando claro contraste entre PEG e P-selectina áreas podem ser usados ​​para confirmar se a impressão é bem sucedida. Sharp, bordas retas pode ser observado quando a estampagem é feita assim. Duro pressionando do selo pode resultar em deformação do selo que limita a prec...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Human promyelocytic leukemia cells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>CCL-240</td>
<td>HL60 cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Gold-coated glass slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMF</td>
<td>TA134</td>
<td>Gold slides</td>
</tr>
<tr>
<td>(1-Mercaptoundec-11-yl)tetra(ethylene glycol)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>674508</td>
<td>PEG</td>
</tr>
<tr>
<td>Recombinant human P-selectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D Systems Inc.</td>
<td>ADP3-050</td>
<td>P-selectin</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine serum albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rockland Immunochemicals, Inc.</td>
<td>BSA-50</td>
<td>BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco's phosphate buffered saline </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech Inc.</td>
<td>21-030</td>
<td>DPBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Sulfuric acid </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>339741</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrogen peroxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>316989</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

studying cell rolling trajectories on asymmetric receptor patterns

Deslocamento lateral de células ortogonais a um fluxo fluxo rolando sobre os padrões assimétricos receptor apresenta uma oportunidade para o desenvolvimento de novos dispositivos para a etiqueta livre de separação e análise de células 1. Tais dispositivos podem utilizar deslocamento lateral para separação de fluxo contínuo, ou padrões de receptores que modulam a adesão ao distinguir entre fenótipos celulares diferentes ou níveis de expressão do receptor. Compreensão da natureza das trajetórias de células rolando no receptor-padrão substratos é necessária para a engenharia dos substratos e desenho de tais dispositivos. Aqui, nós demonstramos um protocolo para o estudo de trajetórias de células rolando sobre os padrões de receptor assimétrica que suporte adesão celular rolando 2. Bem definida, M escala padrões de P-selectina receptores foram fabricados utilizando a impressão em microcontact revestidas de ouro slides que foram incorporados em uma câmara de fluxo. HL60 células que expressam o ligante PSGL-1 3 foram fluiu através de um campo de linhas de estampados e visualizadas em um microscópio de campo invertido brilhante. As células laminadas e monitorados ao longo das bordas inclinadas dos padrões, resultando em um deslocamento lateral. Cada célula tipicamente enrolada por uma certa distância ao longo das bordas padrão (definido como o comprimento de rastreamento borda), individual a partir da borda, e recolocado a um padrão de downstream. Embora essa separação torna difícil acompanhar toda a trajetória de uma célula de entrada até a saída da câmara de fluxo, de partículas de rastreamento de software foi utilizado para analisar e produzir as trajetórias de rolamento das células durante o tempo em que eles estavam se movendo em um único receptor com estampas de linha. As trajetórias foram então analisados ​​para obter distribuições de velocidades de rolamento de células e os comprimentos borda de rastreamento para cada célula de padrões diferentes. Este protocolo é útil para a quantificação de células trajetórias rolando sobre os padrões de receptor e relacionando estes parâmetros de engenharia para como padrão e ângulo de tensão de cisalhamento. Esses dados serão úteis para o design de dispositivos microfluídicos para a etiqueta livre de separação de células e análise.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns at JoVE.com

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Nós descrevemos um protocolo de observar e analisar as trajetórias de células rolando no assimétrica receptor-padrão substratos. Os dados resultantes são úteis para a engenharia de receptor-padrão substratos para a etiqueta livre de separação de células e análise.

Estudando Trajetórias celular Rolamento no Patterns Receptor Asymmetric

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

studying-cell-rolling-trajectories-on-asymmetric-receptor-patterns

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.5K visualizações.  MIT - Massachusetts Institute of Technology. Nós descrevemos um protocolo de observar e analisar as trajetórias de células rolando no assimétrica receptor-padrão substratos. Os dados resultantes são úteis para a engenharia de receptor-padrão substratos para a etiqueta livre de separação de células e análise.