Imageamento de amostras biológicas com microscopia ótica e confocal

Visão Geral

Fonte: Peiman Shahbeigi-Roodposhti e Sina Shahbazmohamadi, Departamento de Engenharia Biomédica, Universidade de Connecticut, Storrs, Connecticut

Os microscópios ópticos existem há séculos e, embora tenham atingido sua limitação teórica de resolução décadas atrás, novos equipamentos e técnicas, como o processamento de imagens confocal e digital, criaram novos nichos no campo da imagem óptica. Os melhores microscópios ópticos normalmente terão uma resolução de até 200 nm em condições ideais. No entanto, os microscópios ópticos são limitados pela difração das ondas, uma função do comprimento de onda, que é em torno de 500 nm para luz visível. Embora a resolução de microscópios ópticos não atinja a dos microscópios eletrônicos, eles são as ferramentas mais valiosas na imagem das macroestruturas biológicas e são um grampo em qualquer laboratório biológico.

Nos microscópios de luz convencionais, o sinal produzido a partir do objeto imaged é da espessura total do espécime, o que não permite que a maioria dele esteja em foco para o observador. Isso faz com que a imagem tenha "desfocado fora de foco". O microscópio confocal, por outro lado, ilumina a amostra através de um orifício de pinos e, portanto, é capaz de filtrar a luz fora de foco de cima e abaixo do ponto de foco no objeto.

Esta demonstração fornece uma introdução à aquisição de imagens usando métodos de microscopia óptica e confocal. Aqui, um pedaço seccionado do cérebro do rato será estudado.  A aquisição e análise de imagens, incluindo as ferramentas para gerar mapas topográficos e imagens compostas, serão abordadas. As vantagens e desvantagens de diferentes métodos de imagem no que se referem à resolução, profundidade de foco e tipo de amostra também serão discutidas. O objetivo desta demonstração é fornecer mais informações sobre microscópios ópticos e confocal para determinar se esses módulos de microscopia são os mais adequados para um tipo de amostra biológica.

Procedimento

1. Imagem confocal

  1. Coloque a amostra no palco. Centralizar-o sob as lentes. Não deve exceder a limitação de peso do estágio, que neste caso é de 5 kg. A amostra não deve ter mais de 100 mm de espessura.
  2. Abra o software de imagem e selecione "Criar trabalho".
  3. Na Coluna Topografias,escolha o botão assistente.
  4. Crie uma imagem de visão geral na menor ampliação, 2,5X. Antes de mudar as ampliações, certifique-se de que a amostra está em foco alterando a posição Z até ver uma ima

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Resultados

As imagens a seguir dão uma visão geral dos resultados que podem ser obtidos de um cérebro de rato usando um microscópio confocal. Eles mostram como diferentes níveis de informação podem ser obtidos e como um mapa topográfico dos resultados revela a altura da amostra.

Figure 5
Figura 5: ...

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Aplicação e Resumo

Nesta demonstração, a profundidade de foco, campo de visão e resolução máxima e ampliação de microscópios ópticos e confocal foram otimizados para visualizar amostras biológicas. Esta demonstração foi projetada para ajudar o participante a decidir qual módulo de microscopia é o melhor para uma determinada aplicação. Ambos os modos de microscopia têm vantagens na análise de amostras biológicas para sua facilidade de preparação e imagens compostas de alta resolução.

As ap...

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Pular para...

0:07

Overview

1:26

Principles of Confocal Microscopy

3:37

Confocal Imaging

6:09

Digital Optical Microscope

7:56

Results

9:05

Applications

10:16

Summary

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