<p class="jove_content"> Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health. </p>

<p class="jove_title"> Parte 1: Preparação do tecido </p><ol><li> Euthanize o peixe-zebra adulto com buffered MS-222 (Ethyl 3-aminobenzoato sal metanossulfonato, 0,03%). </li><li> Decapitar o peixe. Cortar o maxilar inferior, coloque a cabeça na almofada dissecção com o lado ventral para cima, e imobilizar o tecido com pinos de insetos. Remover o tecido mole ventral no crânio e se abrir a parte ventral da cápsula crânio com um par de pinças finas sob um microscópio de dissecação. </li><li> Fixar a cabeça de peixe em paraformaldeído (4%) a 4 ° C durante a noite. </li><li> Lavar a cabeça de peixe fixados em PBS (Phosphate Buffered Saline, 1X) por 3 vezes, 5 minutos de cada vez. </li></ol><p class="jove_title"> Parte 2: Gross dissecção da orelha interna </p><ol><li> Coloque o peixe cabeça na almofada dissecção com o lado ventral. Imobilizá-lo com alfinetes de insetos. Todas as etapas seguintes são realizadas no microscópio de dissecação. </li><li> Com um par de pinças finas, remova o osso do crânio sobre o ouvido interno e, em seguida, puxe cuidadosamente para fora dos tecidos do ouvido interno: sáculos, lagenae, e utrículos. Sáculo e lagena são fortemente anexar ao outro e, assim, retirar juntos enquanto o utrículo (anterior ao sáculo e lagena), muito provavelmente a ser destacado da outra extremidade órgãos durante a dissecção. </li><li> Coloque os tecidos do ouvido interno em PBS (1X). Se não houver dissecção mais fino é necessário, lave o tecido 2-3 vezes com PBS (1X) e pode ser utilizado para outros experimentos, criosecções por exemplo. </li></ol><p class="jove_title"> Parte 3: dissecção fina do epitélio sensorial do ouvido interno </p><ol><li> A dissecção fina pode ser realizada em uma gota de PBS (1X) em uma lâmina de vidro limpa. </li><li> Remover o otólitos do utrículo utricular com dois pares de pinças finas, e, se desejar, corte o tecido não-sensoriais epiteliais e da inervação da epitélios com um par de pinças finas e uma lâmina de agulha. </li><li> Remover o otólitos lagenar antes de separar sacular e lagenar epitélio, enquanto tentar manter o sáculo toda tão intacto quanto possível. Coloque o tecido na queda PBS com até lado ventral. Use a lâmina de agulha para corte cuidadosamente entre o sáculo e lagena. Corte o tecido não-sensorial excessiva epiteliais e os innvervation com uma pinça fina e da lâmina da agulha, se desejar. </li></ol><p class="jove_title"> Parte 4: coloração fluorescente das células ciliadas no epitélio sensorial </p><ol><li> Lavar o epitélio sensorial com PBT (1XPBS e 1% Triton X-100) por 3 vezes, 5 min de cada vez. </li><li> Incubar os epitélios com fluophore marcado phalloidin (por exemplo, farinha Alexa 488 faloidina, 1:1.000 diluição) por 30 min em temperatura ambiente. </li><li> Lavar o epitélio sensorial com PBT de 3 vezes, 10 min de cada vez. </li><li> Monte o epitélio sobre uma lâmina com meio de montagem e verificar o tecido manchado sob o microscópio fluorescente com filtros do comprimento de onda adequado. </li><li> Após a dissecção de sucesso e coloração, epitélio intacto, com forte coloração feixe capilar célula pode ser visto sob o microscópio (Fig. 1). </li></ol><p class="jove_content"><img src="/files/ftp_upload/1211/fig1.png" alt="Figura 1" /><br /> <strong>Figura 1. Células ciliadas do epitélio sacular sensoriais foram coradas com Farinha Alexa 488 faloidina (Green).</strong> A amostra de tecido foi dissecada e coradas como mencionado no jornal. Várias fotos foram tiradas em diferentes posições da amostra e azulejos em conjunto com o Adobe Photoshop 7.0. <br /> Barra de escala = 150μm. </p>

<p class="jove_content"> Neste protocolo, descrevemos a dissecção grossa e fina do epitélio sensorial do ouvido interno de peixe-zebra adulto, o que nos permite preparar amostra de tecido para estudar as características celulares e subcelulares do epitélio sensorial. </p><p class="jove_content"> , A fim de realizar uma dissecação de sucesso, o primeiro passo, a fixação, é muito importante. Certifique-se que você sempre usa solução paraformaldeído preparados na hora, porque solução antiga resultará em menos de fixação de tecid...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5040</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS (Phosphate-buffered Saline, 10X)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mediatech</td>
<td>46-013-CM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 phalloidin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A12379</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI</td>
<td>Reagent</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insect pins</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26000-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scissors</td>
<td>Tool</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5880</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tweezers</td>
<td>Tool</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-5045</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle blade</td>
<td>Tool</td>
<td>Sharpoint</td>
<td>78-6810</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent microscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Zeiss</td>
<td>Axiovert 200M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection pad</td>
<td>Tool</td>
<td>eNasco</td>
<td>SB07840M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zebrafish</td>
<td>Animal</td>
<td>various</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

gross and fine dissection of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish (<em>danio rerio</em>)

<p class="jove_content"> Neurossensorial epitélio do ouvido interno são as estruturas cruciais para as funções de audição e equilíbrio. Portanto, é importante compreender as características celulares e moleculares do epitélio, que são compostas principalmente de dois tipos de células: células ciliadas (HC) e células de apoio (SCS). Aqui nós escolhemos estudar o epitélio sensorial do ouvido interno em zebrafish adulto não só porque as estruturas epiteliais são altamente conservada em todos os vertebrados estudados, mas também porque o peixe-zebra adulto é capaz de regenerar HCs, uma capacidade que os mamíferos perdem logo após o nascimento. Nós usamos a orelha interna do peixe-zebra adulto como um sistema modelo para estudar os mecanismos de regeneração interior HC ouvido nos vertebrados adultos que poderiam ser úteis para a terapia clínica da audição / déficits na balança humana, como resultado da perda de HC. </p><p class="jove_content"> Aqui demonstramos como fazer dissecções bruta e multa de epitélios sensoriais do ouvido interno em peixe-zebra adulto. A dissecção macroscópica remove os tecidos ao redor do ouvido interno e é útil para preparar cortes de tecido, o que nos permite examinar a estrutura detalhada do epitélio sensorial. A dissecção fina limpa os tecidos não-sensoriais-epitelial de cada epitélio individuais e nos permite examinar a heterogeneidade do epitélio todo facilmente em todo o monte amostras epiteliais. </p>

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Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

<p class="jove_content">O epitélio sensorial do ouvido interno zebrafish adultos é um sistema bom modelo para a compreensão dos mecanismos de regeneração das células ciliadas nos vertebrados adultos. Este protocolo demonstra a dissecção fina do epitélio, através do qual podemos obter amostras de tecido para estudar os eventos de regeneração em níveis celular e subcelular.</p>

Dissecação bruta e Multa de Ouvido Interno Epitélio sensorial em adultos Zebrafish (<em> Danio rerio</em>)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (<em>Danio rerio</em>)

16.2K visualizações.  National Human Genome Research Institute. O epitélio sensorial do ouvido interno zebrafish adultos é um sistema bom modelo para a compreensão dos mecanismos de regeneração das células ciliadas nos vertebrados adultos. Este protocolo demonstra a dissecção fina do epitélio, através do qual podemos obter amostras de tecido para estudar os eventos de regeneração em níveis celular e subcelular.

Dissecação bruta e Multa de Ouvido Interno Epitélio sensorial em adultos Zebrafish ( Danio rerio)