Financiado pela NSF (0.854.551).

1. Pré-experimentais Preparações <ol><li> Preparar seis soluções (ver Tabela 1 para as composições): (a) 100 ml NZR (normal zebrafish Ringer), (b) 50 ml NZR + tricaina (MS222), (c) 10 ml NZR + BSA, (d) 100 Locas ml (baixo Ca 2 + solução), (e) 10 ml Locas + papaína, (f) de 100 ml de K +-solução interna. Soluções (a), (b), (d) e (f) pode ser armazenado durante até um mês a 4 ° C. Soluções de (c) e (e) deve ser preparado no dia da experimentação. Todas as soluções devem estar à temperatura ambiente, antes de começar as experiências. </li><li> Etiqueta e encher quatro 35 pratos de Petri milímetros aproximadamente metade com as soluções (a), (c), (d) e (e). </li><li> Fazer um prato de dissecação, preenchendo uma placa de Petri 60 milímetros com Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) e, em seguida, o corte de uma cavidade dentro dela que permitirá que um peixe se sentar direito sem cair. </li><li> Preparar pelo menos duas ferramentas de isolamento de células no final do folículo de colagem de um cabelo cão ao fim de um vidroPipeta de Pasteur com supercola, permitindo que o cabelo se estende para além da extremidade da pipeta por aproximadamente 0,5 cm. Os cabelos de soft-peludos cães como o Labrador Retriever e Weimaraners funcionar bem. </li></ol> 2. Isolamento de auditivos e labirinto vestibular <ol><li> Sacrificar um peixe-zebra adulto por imersão em um copo contendo NZR + tricaina. Monitorar visualmente as guelras até que todos os movimentos operculares cessaram. Esperar mais dez minutos antes de retirar os peixes e enxaguar com NZR fresco. Estes procedimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) da Universidade Pepperdine, mas a aprovação deve ser obtido a partir de sua própria instituição. </li><li> Pin do peixe para o prato de dissecação lado dorsal para cima através da inserção de um pino de costura padrão linear (cerca de 2,5 cm de comprimento) através de cada cavidade ocular e um terceiro pino que passa pelo eixo dorsal-ventral cerca de um terço a metade da distância da cabeça a cauda, ​​como ilustrado naFigura 1A. </li><li> Sob um zoom (0,62-5x) estereomicroscópio equipado com estéreo oculares 10x, utilize uma tesoura fina de mola (número de catálogo da Ciência Ferramentas 15000-02) para expor o cérebro e um segmento curto da medula espinhal, removendo da calota craniana a partir de um ponto aproximadamente 0,5 centímetros caudal ao nível das guelras para a frente para o nariz do peixe. Cortar a medula espinhal e levantar o cérebro com uma pinça fina (Fina Ciência número de catálogo Ferramentas 11251-30) ao cortar os nervos espinhais e outros anexos; remover o cérebro e descartar (Figura 1B). </li><li> A metade ventral da cápsula crânio que permanece forma uma &quot;tigela&quot; que contém os órgãos do ouvido interno. Observe as proeminentes, branco, otólitos opaco no lagenas e sáculos localizados simetricamente na extremidade caudal de cada orelha interna e otólitos utrículo lateralmente posicionados mais rostralmente (Figuras 1C e 4A). </li><li> Remover o copo de osso, cortando todos attachmen ventral e lateralts enquanto suavemente levantando-a da cabeça com uma pinça fina. Colocá-lo na placa de Petri contendo Locas (Figuras 1D e 4B). </li><li> O uso de dois pares de pinças finas, rachar além da tigela na sua linha média ou por agarrar as bordas laterais do osso e separá-las ou, em alternativa, separando as metades direita e esquerda, inserindo os pontos de pinça no centro e erguer as metades separados. Remover os dois labirintos do osso utilizando uma pinça fina (Figura 2). </li><li> Inspecione os labirintos para identificar o auditivo e vestibular finais órgãos: os canais semicirculares, utrículos, sáculos e lagenas (Figura 4C). As áreas rosadas sob cada otólitos são as manchas que contém as células ciliadas. Do mesmo modo, uma tira de cor de rosa no interior do ampolas dos canais semicirculares identifica a cúpula, onde as células ciliadas estão localizados. </li><li> Remova cuidadosamente os otólitos do utrículo lagena e usando a pinça fina ( <strong&gt; Figuras 2 e 4C). Não é necessário remover o otolítica do sáculo pois isso pode danificar as células ciliadas saculares. </li></ol> 3. Isolamento de células ciliadas <ol><li> Utilizando uma pipeta de transferência de plástico (Fisher Scientific número de catálogo 13-711, 09:00), mover os órgãos terminais da placa contendo Locas + papaína minimizando o volume de líquido transferido. </li><li> Incubar estas estruturas nesta solução durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> No final do período de incubação, as estruturas para mover o prato contendo NZR + BSA e incubar nesta solução durante pelo menos trinta minutos. Células ciliadas permanecerá saudável nesta solução durante até quatro horas, mas irá deteriorar-se depois de 1-2 horas após o isolamento (ver passos seguintes). </li><li> Em preparação para o isolamento de células, mover um dos órgãos finais para o prato contendo NZR. </li><li> Para os lagenas e utrículos, use um fio de cabelo cão a levantar delicadamente os lençóis máculas de ti-epitelial rosadassue que contêm as células ciliadas (Figura 3A). O máculas pode ser esvaziado (usando um pêlo de cão) sob os otólitos do sáculos, e cúpulas de seus locais dentro do ampolas dos canais semicirculares. </li><li> Utilizando duas ferramentas de células de isolamento elaboradas no passo 1.4, tritura-se uma mácula ou cúpula para gerar um campo que contém os restos de células ciliadas (Figura 3B). Permitir que as células, pelo menos, cinco minutos para se instalar no fundo do prato antes de movê-lo. </li><li> Relocalizar o prato para a fase de um microscópio invertido equipado com óptica de contraste de fase. Observar células em aumento de 40 vezes e observe a diversidade na morfologia. Muitas células são abacate em forma, enquanto outros são longos e finos. A presença de feixes capilares apicais identifica-as como células ciliadas e fase-brilho assegura a sua saúde. Fotomicrografias de células ciliadas isolados são mostrados na Figura 5. </li></ol> 4. Patch clamping células ciliadas Zebrafish <ol><li> Em preparação para perforemendo nominal gravações 5,6, contendo anfotericina preparar solução interna como se segue: 5 mg lugar anfotericina B (Sigma A4888) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e encher com 100 uL de DMSO. Imediatamente vortex esta solução durante 10-20 segundos até que toda a anfotericina é dissolvido. Em seguida, pipeta K 625 ul + solução interna para um tubo de microcentrífuga de segundo. Adicionar 10 ul da solução de anfotericina ao K +-interno e solução de vórtice como acima. A solução de anfotericina estoque vai durar várias horas, mas descartar a solução final, após uma hora. </li><li> Fabricar pipetas de patch BF 150-86-10 vidro borosilicato (Sutter Instruments), utilizando um extrator de multi-estágio (Sutter P-1000). Pipetas de ponta deve ter diâmetros de cerca de 2 micrómetros e têm resistências de 1-3 MQ, com as soluções da Tabela 1. As definições sobre o extrator que funcionam bem são os seguintes: Calor = Rampa minus10, Pull = 0 Velocidade, = 18 Delay, Pressão = 1, = 600. A forma daa ponta de uma pipeta de bom é evidente a partir da fotografia no c inserção da Figura 5. Blunt &quot;em forma de bala&quot; pipetas são preferidas como eles oferecem a menor resistência acesso durante gravações eletrofisiológicas. </li><li> Use uma agulha de seringa de calibre 28 Microfil (MF28G-5; Instrumentos de Precisão Mundo) para preencher um eletrodo de registro até a metade com o K + anfotericina contendo interna solução. </li><li> Apor a eletrodo para o andar de entrada de um amplificador de patch clamp. Aplicar -10 mV, 10 degraus de tensão ms a 10 Hz e manter uma pressão positiva no eléctrodo em que é manobrado por meio da interface ar / solução e para baixo para o fundo do prato de gravação junto das células. </li><li> Posicione o eletrodo ortogonalmente a uma célula saudável. Quando o eléctrodo é suficientemente próxima para a célula de modo a que ele começa a afastar-se da solução de saída de fluxo, reverter rapidamente a pressão, a aplicação de um vácuo ligeiro ao eléctrodo até que a célula &quot;salta&quot; para dentro dele. Cessar imediatamente sucção no diaeléctrodo e e aplicar um potencial de retenção de -70 mV para o interior do eléctrodo. Dentro de poucos segundos um selo gigaohm irá se formar. </li><li> Observe os transientes corrente capacitiva no início e término das etapas de tensão que aparecem logo após a formação do selo. Continuar a monitorizar a perfuração da membrana sob o eléctrodo pelo anfotericina observando como os transientes de crescer em magnitude ao seu tamanho máximo (em cerca de 10 minutos). </li><li> Para confirmar o estabelecimento de células inteiras de configuração (perfurada) em uma célula saudável, eliciar exteriores correntes de K + através da aplicação e hiperpolarizante despolarizante passos de voltagem. A maioria das células de cabelo têm importantes correntes exteriores (ver Figura 6). </li></ol> 5. Resultados representativos A Figura 4 mostra imagens obtidas durante as etapas de isolamento de células. No painel A, os otólitos associados aos lagenas, saccluli e utrículos pode ser visto through a fina camada de osso que se sobrepõe a eles. Estas estruturas opacas fornecer pontos de referência conveniente para ajudar na remoção segura dos órgãos terminais do animal durante as etapas subsequentes da dissecção. O painel B mostra o &quot;tigela&quot; de osso que contém os labirintos intactas e os otólitos proeminentes nos utrículos, lagenas e sáculos. O painel C mostra um labirinto que tenha sido removido a partir do osso. Observe o otólito grande com a borda recortada no lagena, o otólito icicle em forma de sáculo e do otólito em forma de feijão no utrículo. Alguma da diversidade no tamanho e na morfologia observada em células isoladas da lagena é ilustrado na Figura 5. Uma célula saudável é prontamente identificado como sendo de fase brilhante, com um perímetro afiada. Formas celulares podem ser divididos em duas classes: em forma de abacate (avo) e longo e fino (thn), embora os tamanhos das células dentro de cada grupo pode variar acentuadamente (compare, por exemplo, um avo e avo 3). Inserção de uma mostra um aglomerado detrês células que não foram completamente isoladas umas das outras. A cor preta e aparência granular da célula em b inset facilmente identifica esta célula como mortos. C inserção mostra a ponta de uma pipeta de patch ilustrando a forma e dimensões apropriadas para a gravação a partir destas células. Os traços de corrente mostradas na Figura 6 foram obtidos em resposta à despolarização e hiperpolarização do potencial passos impostas a uma célula lagena semelhante ao avo 2 mostrado na Figura 5. Respostas actuais em células de diferentes tamanhos e formas podem variar amplamente sugerindo diversidade no complemento de canais dependentes da voltagem. As Figuras 1-3 ilustram os passos: Desenhos no isolamento das células ciliadas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig1.jpg" /> Figura 1. A remoção do crânio capsule contendo os labirintos do ouvido interno do peixe-zebra. Uma. Pin sacrificado lado dorsal do peixe-zebra até dissecar prato. B. Crânio aberto, remover e descartar cérebro. C. Observe otólitos em utrículos, lagenas e sáculos. D. Remover porção ventral do crânio cápsula contendo os labirintos. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig2.jpg" /> Figura 2. Remoção de labirintos de cápsula crânio. A. Quebrar em pedaços da cápsula, na sua linha média do crânio. B. Remover labirintos de osso. C. Retire os otólitos dos lagenas e utrículos usando uma pinça. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig3.jpg" /> Figura 3. Isolamento de células capilares de labirintos. A. Delicadamente levante maculae com um pêlo de cão. B. Triturar máculas com dois fios de cabelo do cão. C. Utilize células ciliadas isoladas para patch clamp. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig4.jpg" /> Imagens de Figura 4. Tomadas durante os passos de isolamento de células individuais. A. Após a remoção do cérebro, os otólitos associados aos dois lagenas e sáculos (setas) e utrículos (pontas de seta) pode ser visualizada. B. Após a remoção do ventral porção da cápsula de crânio que contém os órgãos do ouvido interno a partir do animal. O desenho animado na metade direita do B identifica os locais do utrículo esquerda, lagena e sáculo. A linha tracejada indica a posição aproximada do labirinto esquerdo. C. Labirinto direito (vista medial) D: Desenho dos desenhos animados ilustrando partes importantes do labirinto em C. a: semi anteriorcircular canal, b: canal horizontal, c: canal posterior, d: utricular otólito, e: sacular otólito, f: lagenal otólitos. Barra de escala em D representa 1 mm para A e B, 0,5 mm, para C e D. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig5.jpg" /> Figura 5 isoladas, as células saudáveis ​​do lagena ilustrando a diversidade da morfologia; avo:. Abacate células em forma; thn: longos, células finas. Inset uma: cluster de três células isoladas incompleta; inset b: célula morta, c inset: ponta do eletrodo sistema usado em gravações eletrofisiológicas das células ciliadas zebrafish. Barra de escala = 20 um se aplica a figura principal e todas as inserções. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig6.jpg" /> Figura 6. Correntes gravadas em um patch preso células ciliadas. Respostas médias em uma célula (t semelhanteso avo 2 na Figura 5) a três apresentações dos passos a tensão aplicada em incrementos de 10 mV de -140 mV a +70 mV de um potencial de manutenção de -70 mV. Observe o atual inativação que aparece na potenciais mais despolarizadas. Magnitudes degrau de tensão são mostrados ao lado de alguns dos traços.

<ol>
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Não há conflitos de interesse declarados.

Dissecação cuidadosa dos órgãos terminais e tratamento suave das células é essencial para o isolamento de células ciliadas saudáveis, intactos e fisiologicamente activo. Aderindo às dicas a seguir irão garantir o sucesso: <ol><li> É mais fácil de obter a partir de células saudáveis ​​peixes mais pequenos (2-2,5 cm de comprimento). Peixes maiores têm muitas gotículas de gordura que mais obscuro de visualização durante o processo de dissecação. </li><li> Cuidados devem ser tomados ao remover os otólitos, que se sobrepõem às células ciliadas. Evite tocar as células quando pegar os otólitos com pinças. </li><li> Os melhores resultados são obtidos quando as manchas e cúpulas são descolou-se as lâminas e as células do epitélio triturados. </li><li> Nós encontramos o uso de um fio de cabelo cão para triturar as células a ser superior a outros métodos, incluindo a utilização das pestanas humanas 7, que não são tão fina e menos flexível. </li><li> Durante remendo de aperto, a aplicação de pressão positiva a tele eléctrodo à medida que passa através da interface ar / solução é importante para manter a ponta limpa. A libertação da pressão positiva para permitir que a célula de &quot;saltar&quot; sobre o eléctrodo também é importante. Este método elimina um pequeno volume de solução contendo anfotericina longe da ponta, o que aumenta a probabilidade de formação de uma vedação gigaohm com a célula. Nas nossas experiências que utilizam a técnica de gravação em vez de adesivo perfurado o mais tradicional configuração de célula total, devido à fragilidade das células. A tentativa de &quot;ir célula inteira&quot; muitas vezes resulta na perda do selo gigaohm. </li></ol> O método aqui descrito vai produzir centenas de células ciliadas saudáveis ​​por animal. A técnica pode ser realizada à temperatura ambiente e não requer nenhum equipamento especial além de um microscópio de dissecação. Um relatório anterior, em JoVE descreve a dissecção do ouvido interno no peixe-zebra utilizando uma abordagem ventral 8. Esses autores demonstraram a Dissection de inteiros, paraformaldeído-fixados órgãos do ouvido interno. Incentivamos o leitor a assistir a este vídeo para a comparação com os nossos métodos. Uma vantagem dos métodos aqui apresentados é a obtenção de células vivas úteis para investigações fisiológicas. Para além da sua utilização em experiências de patch clamp para estudar os canais dependentes da voltagem (como mostrado aqui) o uso destas células pode ser estendida para o estudo de ressonância célula 9,10, monitor a libertação do neurotransmissor através de medições de capacitância 11,12, investigar neuromodulação induzida pela a ativação de canais fechados ligante 13, bem como explorar a riqueza de informações que pode ser adquirida a partir usando mutantes que afetam tanto a audição e equilíbrio 14.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome da solução </td><td> Receita </td></tr><tr><td> (A) NZR (Normal Zebrafish Ringer) (em mM) </td><td> 116 NaCl, KCl 2, CaCl 2 2, 3 Glucose, 5 de Na +-HEPES, pH 7.35. </td></tr><tr><td> (B) + NZR tricaina </td><td> NZR + 0,02% ácido 3-aminobenzóico etil éster sulfonato de metano (Sigma A5040). </td></tr><tr><td> (C) + BSA NZR </td><td> NZR + 0,4% Albumina de Soro Bovino (Sigma A2153). </td></tr><tr><td> (D) Locas (Baixo Ca 2 + Solução) (em mM) </td><td> 100 NaCl, KCl 2, 0,05 CaCl2, 0,05 MgCl2, 3 Glucose, 30 de Na +-HEPES, pH 7.35. </td></tr><tr><td> (E) + Locas papaína </td><td> Locas + 0,05% de L-cisteína (Sigma C1276) + 0,2% de papaína (Sigma P3375). </td></tr><tr><td> (F) K +-solução interna (em mM) </td><td> 52 K 2 SO 4,38 KCl, 1-K + EGTA, 5 K +-HEPES, pH 7,3. </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Solutions.

patch clamp recordings in inner ear hair cells isolated from zebrafish

Patch clamp análises dos canais dependentes da voltagem nas células pilosas sensitivas isoladas a partir de uma variedade de espécies foram descritas anteriormente, mas este vídeo 1-4 representa a primeira aplicação de tais técnicas às células ciliadas do peixe-zebra. Aqui demonstramos um método para isolar saudáveis, células ciliadas intactas a partir de todos os ouvido interno finais órgãos: sáculo, lagena, utrículo e canais semicirculares. Além disso, demonstramos a diversidade no tamanho e morfologia das células do cabelo e dar um exemplo dos tipos de gravações de patch clamp que podem ser obtidos. A vantagem da utilização deste sistema modelo zebrafish sobre os outros deriva da disponibilidade de peixe-zebra mutantes que afectam tanto a audição e equilíbrio. Em combinação com a utilização de linhas transgénicas e outras técnicas que utilizam a análise e manipulação genética, o isolamento de células e métodos electrofisiológicos introduzida aqui deve facilitar uma maior compreensão dos papéis células ciliadas pestava na mediação dessas modalidades sensoriais.

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Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

O objectivo deste vídeo é demonstrar os procedimentos para a obtenção de células ciliadas saudáveis, intactas a partir dos órgãos do ouvido interno de peixes-zebra adultos e, em seguida, utilizando-os para os estudos de patch clamp para caracterização das propriedades biofísicas dos seus canais dependentes da voltagem.

Gravações patch clamp em células ciliadas da orelha interna Isolado de Zebrafish

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

patch-clamp-recordings-in-inner-ear-hair-cells-isolated-from-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K visualizações.  Pepperdine University. O objectivo deste vídeo é demonstrar os procedimentos para a obtenção de células ciliadas saudáveis, intactas a partir dos órgãos do ouvido interno de peixes-zebra adultos e, em seguida, utilizando-os para os estudos de patch clamp para caracterização das propriedades biofísicas dos seus canais dependentes da voltagem.

Vídeo: Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Neurociência

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Gravações patch emparelhado Grampo da Motor-neurônio e músculo alvo ósseas em Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the postsynaptic activity of a single ribbon synapse 1-4. Ribbon synapses of sensory cells release neurotransmitter continuously, the rate of which is modulated in response to graded changes in IHC membrane potential 5. Ribbon synapses have been shown to operate by multivesicular release, where multiple vesicles can be released simultaneously to evoke excitatory postsynaptic currents (EPSCs) of varying amplitudes 1, 4, 6-11. Neither the role of the presynaptic ribbon, nor the mechanism underlying multivesicular release is currently well understood.
The IHC is innervated by 10-20 auditory nerve fibers, and every fiber contacts the IHC with a unmyelinated single ending to form a single ribbon synapse. The small size of the afferent boutons contacting IHCs (approximately 1 &mu;m in diameter) enables recordings with exceptional temporal resolution to be made. Furthermore, the technique can be adapted to record from both pre- and postsynaptic cells simultaneously, allowing the transfer function at the synapse to be studied directly 2. This method therefore provides a means by which fundamental aspects of neurotransmission can be studied, from multivesicular release to the elusive function of the ribbon in sensory cells.

Whole-cell patch-clamp recordings from auditory nerve fiber dendrites at the inner hair cell ribbon synapse in the mammalian cochlea.

Gravações pós-sinápticos em Dendrites aferente entrar em contato com células ciliadas da cóclea: Release multivesiculares Monitoramento em uma fita Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Isolando-LacZ expressar Células de tecidos de camundongos Inner Ear usando Citometria de Fluxo

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Transferência de genes para a orelha do camundongo Desenvolvimento Inner por<em&gt; In Vivo</em&gt; Eletroporação

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Grampo patch Gravações de Embryonic Cells Zebrafish Mauthner

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-cell Recordings patch-clamp de Morphologically- e identificados Neuroquimicamente hipocampo Interneurônios

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Eletrofisiológica e Caracterização Morfológica de Neuronal Microcircuits em aguda fatias do cérebro do Usando Emparelhados patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcelulares Gravações patch-clamp do domínio somatodendrítico da substância negra dopamina Neurônios

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...