Os autores agradecem Chris Chartrand, HT (ASCP) para demonstrar a secção de corte do bloco de células com marcador AV.

Introdução: Este é um vídeo que descreve o método Shidham para a preparação de células bloco de líquidos à base de amostra citologia (LBC), utilizando HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). Em comparação com outras abordagens aleatórias, são as duas características essenciais deste protocolo para a preparação de blocos de células a partir de amostras relativamente hipocelular com células isoladas espalhadas soltas (1-5). <ol><li> Este protocolo envolve as etapas de concentrar as células ao longo do plano paralelo à superfície de corte do bloco de células. </li><li> Também inclui uma inclusão beacon-like escuro da AV-marcador (Figura 1b), que serve duas das seguintes finalidades: <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Para visualizar o nível em que as células estão concentradas. A área do bloco de células com as células de interesse agora pode ser visualizado pelo histotechnologist quando o farol de cor escura é exposto durante o corte. Esta capacidade de monitorar o impediriam de corte através do nível com a maioria das células, ou não cortar demasiado superficial para o nível com maior concentração de células da amostra. </li><li> Para servir como um ponto de referência de localização na seção de série célula bloco em slides diferentes. Este ponto de referência atua como um farol para ajudar a localizar células ou grupos específicos de células para avaliação de um padrão de imunorreatividade coordenar com a abordagem SCIP (6,7). </li></ol></li></ol> PROTOCOLO (Figura 2) Preparação da amostra. <ol><li> Transferir a amostra residual LBC citologia cervical para um tubo com fundo de vidro planas (15mm de diâmetro x 45mm) (Figura 2.1 a 2.4). Coloque o tubo de vidro em uma grande tubo plástico transportadora (28 x 85 milímetros) e centrifugar. Retire o tubo com fundo de vidro do tubo transportador e despeje o sobrenadante. </li><li> O tubo de vidro é então tampado (para evitar derramamento de aquecimento de água na próxima etapa) e colocado de volta dentro de um flat tubo maior fundo de plástico transportadora </li><li> O tubo de plástico contendo transportadora o tubo de vidro é então tampado, colocados em uma centrífuga (com xícaras giratórias e não copos ângulo fixo para que as células incidem perpendicularmente ao fundo plano do tubo de vidro), e girou em 1805 G (3000 rpms, raio-17cm rotor) por cinco minutos (Figura 2.5). </li><li> Os tubos são então removidas verticalmente a partir da centrifugação e do tubo de vidro menor é retirado com uma pinça a partir do maior tubo de plástico sem perturbar o sedimento sedimentada com as células. </li><li> O tubo de vidro com a amostra é destampado eo sobrenadante é decantado tomando cuidado para não perturbar a camada plana de células de sedimentos no fundo (Figura 2.6). </li></ol> Inclusão das coordenadas de referência AV marcador e adição de gel <ol><li> Um farol escuro AV-marcador (cerca de 2 mm X 2 mm de tamanho, superfície plana, fragmento de material escuro, colorido sectionable) (Figura 3) é adicionado como um sinal para o tubo de vidro (Figura 2.7). </li><li> Liquefazer uma alíquota de HG pelo derretimento em microondas por 10 segundos na potência média. </li><li> Adicionar 0,5 ml de HG fundido ao tubo de mistura, com o sedimento rapidamente, e recap-lo (Figura 2.8) (Vá para o próximo passo rapidamente, sem permitir que o HG para começar a solidificar). </li><li> Adicionar cerca de 2,5 ml de água morna (45 ° C) de água para o tubo de plástico transportadora (Figura 2.9). </li><li> O tubo de vidro tampado menor é colocado dentro do tubo de plástico com água morna. (Este passo é necessário para manter o HG de solidificar durante os próximos passos) (Figura 2.9). </li><li> O tubo de plástico transportadora é colocada na centrífuga (com xícaras giratórias e não copos ângulo fixo para que as células incidem perpendicularmente ao fundo plano do tubo de vidro), e girou em 1805 G (3000 rpms, raio-17cm rotor) por cinco minutos. O objetivo desta etapa de centrifugação é para empurrar o marcador AV-e concentrar as células em uma camada mais próxima da superfície de corte do último bloco de celas incluído em parafina (Figura 1d). </li><li> Os tubos são então removidas com cuidado e verticalmente a partir da centrífuga tomando cuidado para não perturbar a camada sedimentada fina com células da amostra na parte inferior. </li><li> O tubo plástico é maior sem tampa eo tubo de vidro menor é removido verticalmente por uma pinça, sem perturbar a camada de sedimento de células da amostra. </li><li> O tubo de vidro pequeno é refrigerado na posição vertical por 15 minutos para esfriar e solidificar o HG (Figura 2.11). </li></ol> Remoção dos blocos de células como um botão de gel com a amostra para o processamento final <ol><li> O disco HG solidificado, com a camada de concentrado / sedimento amostra no fundo é desalojado do tubo plana com fundo de vidro por esguichando formalina a 10% através de uma agulha de calibre 23 com a seringa (Figura 2.12). </li><li> A agulha é inserida ao longo da lateral do tubo na periferia do disco solidificou HG com a amostra (Figura 2.12). </li><li> O needle é rodado ao longo do lado do tubo, enquanto formol está lentamente empurrado através da seringa. Isso resulta na separação do botão HG junto com farol de cor escura AV-marcador e da amostra concentrada nele desde o fundo plano do tubo de vidro (Figura 2.12). </li><li> O bloco de células (botão gel com células amostra) é então colocada em um cassete rotulado e submetido a processamento de tecidos para preparar blocos parafinados de células (Figura 2.13). </li></ol> Incorporação e corte do espécime <ol><li> O disco está embebido em parafina com o lado escuro farol marcador para baixo como superfície de corte (Figura 1). </li><li> O bloco é seccionada até a cor escura marcador de AV como um farol é exposto e claramente visíveis. </li><li> Três a quatro seções micron são cortados a partir deste nível que deve conter a maioria das células isoladas espalhadas a partir do espécime. </li><li> As seções são coletados na lâmina de vidro para coloração mais, coloração imuno-histoquímica, ou outros testes, como indicado. Os protocolos para estes testes, incluindo o tipo de slides para utilizar para a montagem das seções pode variar. Geralmente para imunomarcação, slides revestidos são usados ​​para prevenir flutuante e perda de seções do slides durante as etapas de imunocoloração. </li></ol> Abreviaturas utilizadas (em ordem alfabética): CISH, cromogênico testes de hibridização in-situ; FISH, Fluorescente testes de hibridização in-situ; FFPE, parafina fixadas em formalina; FNA, aspirativa por agulha fina; HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, citologia líquida baseada; PCR reação em cadeia da polimerase; <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1. A estrutura do bloco de celas preparado pelo protocolo de Shidham. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2. O resumo das diferentes etapas para a preparação de blocos de células de uma amostra LBC por protocolo de Shidham. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig3.jpg" alt="figura 3" /> Figura 3. Preparação de AV-marcador de cascas de banana. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig4.jpg" alt="figura 4" /> Figura 4. Comparação de blocos de células e seções com e sem AV-marcador. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig5.jpg" alt="figura 5" /> Figura 5. Comparação de celularidade das seções do bloco de células com e sem AV marcador.

<ol>
	<li>Shidham, V. B., Epple, J., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14,+Appendix+I:+Collection+and+processing+of+effusion+fluids+for+cytopathologic+evaluation.">Chapter 14, Appendix I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , .</li><li>Varsegi, G., D'Amore, K., Shidham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p16INK4a+Immunocytochemistry+as+an+Adjunct+to+Cervical+Cytology+-+Potential+Reflex+Testing+on+Specially+Prepared+Cellblocks+from+Residual+Liquid+Based+Cytology+(LBC)+Specimens.">p16INK4a Immunocytochemistry as an Adjunct to Cervical Cytology - Potential Reflex Testing on Specially Prepared Cellblocks from Residual Liquid Based Cytology (LBC) Specimens.</a> Modern Pathology 22: 98th Annual Meeting of United States and Canadian Academy of Pathology. , 97a-97a (2009).</li><li>Nigro, K., Tynski, Z., Wasman, J., Abdul-Karim, F., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell+block+preparation+methods+for+nongynecologic+ThinPrep+specimens.">Comparison of cell block preparation methods for nongynecologic ThinPrep specimens.</a> Diagn Cytopathol. 35, 640-643 (2007).</li><li>Saleh, H. A., Hammoud, J., Zakaria, R., Khan, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Thin-Prep+and+cell+block+preparation+for+the+evaluation+of+Thyroid+epithelial+lesions+on+fine+needle+aspiration+biopsy.">Comparison of Thin-Prep and cell block preparation for the evaluation of Thyroid epithelial lesions on fine needle aspiration biopsy.</a> CytoJournal. 5, 3-3 (2008).</li><li>Kyroudi, A., Paefthimiou, M., Symiakaki, H., Mentzelopoulou, P., Voulgaris, Z., Karakitsos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+diagnostic+accuracy+with+a+cell+block+preparation+from+thin-layer+endometrial+cytology:+a+feasibility+study.">Increasing diagnostic accuracy with a cell block preparation from thin-layer endometrial cytology: a feasibility study.</a> Acta Cytol. 50, 63-69 (2006).</li><li>Atkinson, B. F., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Immunocytochemistry+of+effusion+fluids:+introduction+to+SCIP+approach+(Chapter+5.">Chapter 5: Immunocytochemistry of effusion fluids: introduction to SCIP approach (Chapter 5.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li><li>Shidham, V. B., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+15,+Appendix+II:+Immunocytochemistry+of+effusions+processing+and+commonly+used+immunomarkers.">Chapter 15, Appendix II: Immunocytochemistry of effusions processing and commonly used immunomarkers.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li></ol>

Blocos de células são uma ferramenta valiosa para avaliação das amostras de citologia diversos (1). Mais importante, além de os detalhes arquitetônicos do espécime, blocos de células permitir uma avaliação dos estudos auxiliares, tais como imunocitoquímica, fluorescente / cromogênico testes in-situ (FISH / CISH) e in-situ PCR. Uma variedade de métodos para a preparação do bloco de celas são descritos. No entanto, a maioria destes são adequados para amostras não-ginecológicas citologia que contêm células relativamente muitos e com microfragmentos tecido como em FNA aspirados e alguns fluidos serosos, tais como derrames (1,3,4,5). Porque os blocos de células principalmente proporcionar a oportunidade para a avaliação imunocitoquímicos, seu processamento deve preferencialmente ser semelhante ao da fixadas em formalina parafina (FFPE) tecidos. Em última análise, os resultados obtidos após a avaliação imunocitoquímica de seções bloco de celas são comparados com aqueles com a literatura feita predominantemente em secções de tecido FFPE. Quaisquer alterações no protocolo potencialmente comprometer e anular a validade dos resultados obtidos em blocos de células processadas através fixadores diferentes e seqüências de reagente que não seja usado para FFPE rotina. Algumas técnicas comerciais pode ter o inconveniente de processamento através de um protocolo de exposição à exposição fixador reagentes outros. Vários métodos de preparação de blocos de células estão disponíveis para amostras com uma quantidade significativa de sedimentos e fragmentos de tecido. Principalmente, os sedimentos concentrados são suportados por um pouco de gel ou princípio de coagulação. O botão manobrável é, então, incluídos em parafina após processamento, como os espécimes cirúrgicos patologia / biópsias. Os géis usados ​​incluem gelatina, agar, fibrinogênio / plasma-trombina, e outros géis comerciais, tais como HG. Os métodos de concentração variam de granulação simples do sedimento por centrifugação a concentração de células ao longo de vários tipos de membranas. Os exemplos incluem: Milipore, collodin (celóidina) sacos ou raspagem das células do esfregaço citológico em lâminas de vidro (1). Avaliamos também uma variedade de géis, tentando combinações diferentes de agar e de gelatina. Nenhuma das combinações alcançado a consistência um firme o suficiente para obter um disco facilmente manobrável de gel solidificado com células incorporado a partir da amostra em uma única peça. HG mostrou consistência adequada e em nossa experiência os resultados imunocoloração em seções HG bloco de células têm sido excelentes. Líquidos à base de citologia (LBC) amostras para citologia cérvico-vaginal são geralmente menos celulares que os não-ginecológicas espécimes como mencionado acima. Além disso, as amostras ginecológicas LBC predominantemente conter individuais espalhados esfoliada células superficiais da mucosa cervicovaginal. Devido a isto, celularidade adequada dentro das seções de bloco de células não podem ser alcançados sem uma abordagem especial. Como estes isoladamente espalhados componentes celulares no bloco do não pode ser visto pelo histotechnologist durante o corte seção, o nível em que as células começam a aparecer nas seções não podem ser apreciadas e podem ser perdidas, seja por corte passado o nível com a maioria das células ou não corte profundo o suficiente para o nível com maior concentração de células da amostra (Figura 4). Protocolo Shidham aborda estas duas questões utilizando HG como a incorporação de equipamentos de laboratório de médio e convencional (2) (Figura 2). Este protocolo envolve duas seguintes características principais (Figura 1): <ol><li> Concentração e alinhamento de células isoladas espalhadas em um plano estreito adjacente e paralelo à superfície de corte do bloco de células (Figura 5). </li><li> Inclusão de um farol do tipo escuro AV marcador, como um poste de sinalização. Isto é crítico para atingir seguintes características: <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Identificar e monitorar o nível em que as células estão concentradas no bloco de células. A exposição da placa de sinalização de cor escura ressalta o nível em que a maioria das células isoladas espalhadas no bloco de celas deverão ser localizados (Figura 4). Isso evita que o overcutting (corte passado o nível com a maioria das células) ou subcotação (não corte profundo o suficiente para o nível com maior concentração de células da amostra) para o bloco de células e permitir a seleção das seções do nível do bloco célula correspondente com maior concentração de células. </li><li> A sinalização de cor escura nas seções também serve como um ponto de referência para o levantamento e identificar exatamente as mesmas células em diferentes seções de série do bloco de celas em slides diferentes (Figura 4). Isto é crítico ao interpretar e avaliar as propriedades de coordenadas de células, tais immunoprofile especial, pela abordagem SCIP de seguir as mesmas células em diferentes seções (6,7). </li></ol></li></ol> Apesar de UOr protocolo é padronizada e relatados para amostras de líquidos à base de citologia cervical, também pode ser usado para aumentar o rendimento diagnóstico de muitos outros não-ginecológicas, tais como amostras de fluidos efusão, FNA, escovações, o conteúdo da lesão, etc Além disso, o marcador AV facilitaria melhorou aplicação da abordagem SCIP durante a avaliação imuno-histoquímica de seções bloco de células desses espécimes. O meio de incorporação podem ser substituídos por outros reagentes com as modificações apropriadas nas etapas relevantes. HG pode ser substituído por plasma (fibrinogênio), a ser gelificado por trombina à temperatura ambiente (1).

cell block preparation from cytology specimen with predominance of individually scattered cells

Este vídeo demonstra método Shidham para a preparação de blocos de células de líquidos à base espécimes citologia cérvico-vaginal contendo células individualmente dispersos e grupos de células pequenas. Esta técnica utiliza HistoGel (Thermo Scientific) com equipamentos convencionais de laboratório. A utilização de secções bloco de células é uma valiosa ferramenta auxiliar para avaliação da não-ginecológicas citologia. Eles permitem que o citopatologista para estudar detalhes morfológicos adicionais espécime, incluindo a arquitetura da lesão. Mais importante, eles permitem a avaliação de estudos auxiliares, tais como imunocitoquímica, os testes de hibridização in-situ (FISH / CISH) e in-situ reação em cadeia da polimerase (PCR). Tradicionais técnicas de preparação de blocos de células, têm sido aplicadas a amostras não-ginecológicas citologia, tipicamente para derrame de fluido corporal e biópsias aspirativa por agulha fina. Líquidos à base espécimes cervicovaginais são relativamente menos do que seus celulares não-ginecológicas homólogos com muitas células individuais dispersos. Devido a isso, celularidade adequada dentro das seções bloco de células é difícil de conseguir. Além disso, o corte histotechnologist o bloco não pode visualizar o nível em que as células estão em maior concentração. Portanto, é difícil monitorar o nível adequado em que as seções pode ser selecionado para ser transferido para a lâminas de vidro para testes. Como resultado, a área do bloco de células com as células de interesse podem ser perdidas, seja por corte ou não corte passado profundo o suficiente. Protocolo atual para o método Shidham aborda estas questões. Embora este protocolo é padronizada e relatados para amostras de líquido ginecológico de citologia com base, também pode ser aplicada a não-ginecológicas, tais como amostras de fluidos efusão, FNA, escovações, etc o conteúdo da lesão para melhorar a qualidade de material de diagnóstico em seções bloco de células.

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Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Shidham método para a preparação de blocos de células com marcador de AV partir de amostras de citologia com células individualmente dispersos e grupos de células pequenas.

Preparação Cell Block da amostra citologia com predomínio de células individualmente Scattered

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually ...

cell-block-preparation-from-cytology-specimen-with-predominance

Research

JoVE Journal

Biology

73.2K visualizações.  University of Wisconsin - Milwaukee. Shidham método para a preparação de blocos de células com marcador de AV partir de amostras de citologia com células individualmente dispersos e grupos de células pequenas.

Vídeo: Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  approximately one (to two) million irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells is rinsed with HuES media to remove residual serum and cell debris, and then HuES media added and left to equilibrate in the cell culture incubator.  A frozen vial of cells from long term liquid nitrogen storage or a -80C freezer is sourced and quickly submerged in a 37C water bath for quick thawing.  Cells in freezing media are then removed from the vial and placed in a large volume of HuES media.  The large volume of HuES media facilitates removal of excess serum and DMSO, which can cause HuES human embryonic stem cells to differentiate.  Cells are gently spun out of suspension, and then re-suspended in a small volume of fresh HuES media that is then used to seed the MEF plate.  It is considered important to seed the MEF plate by gently adding the HuES cells in a drop wise fashion to evenly disperse them throughout the plate.  The newly established HuES culture plate is returned to the incubator for 48 hrs before media is replaced, then is fed every 24 hours thereafter.

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.

Células ES: Cultura A partir de células congeladas

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

Biologia

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparação de culturas de neurônios a partir de embriões Midgastrula Stage Drosophila

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

Preparação de uma única célula Suspensões de Spleen rato com o Dissociator gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Preparação de Drosophila Células S2 para microscopia de luz

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Inositol pyrophosphates play an important role in human pathologies such cancer, diabetes and obesity; however, the exact mechanism of action is a matter of dispute. The lack of commercially available inositol pyrophosphates renders detailed studies problematic. Here we describe a simple protocol to produce and isolate milligrams of inositol pyrophosphates.

Preparação de Qualidade pirofosfatos Inositol

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Cromossomo Preparação a partir de células cultivadas

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

Preparação de Primário Miogênica de Células Precursoras / Culturas de mioblastos de Vertebrados basais Linhagens

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Cryo-Microscopia Eletrônica de Preparação de Amostras por meio de um Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...