Suportado pela fundação da Universidade de Illinois em Chicago, bem como celular Islet Resource Center NIH subvenção (RFA-RR 05-003), a Fundação Christopher, a Fundação Efroymson, ea Fundação Tellabs.

1. Purificação de ilhotas <ol><li> Para iniciar o processo de purificação de ilhotas, carregar o saco de COBE, braçadeira todos os tubos exceto o tubo verde, e defina a velocidade para 1.500 e os super fora a 0. </li><li> Na capa configurar os copos bomba e gradiente e conectar o tubo de coleta para o tubo verde. </li><li> Agora o carregamento do Ficoll 1,100 pode começar: push &quot;spin&quot; em seguida, adicione 110 ml de Ficoll 1,100 para o copo da frente, e começar a bomba, a fim de carregar o saco de COBE. Como o Ficoll é carregado, pressione super-out, parar a bomba, unclamp a cabeça da bomba e definir a velocidade com super 100. </li><li> Quando o Ficoll atinge o copo e todo o ar é expulso da tubulação, re-braçadeira na cabeça da bomba. Definir a velocidade de rotação de 3.000, ea velocidade com super 0. </li><li> Agora prepare-se para carregar os gradientes vertendo o gradiente pesado no copo da frente. Ligeiramente liberar o grampo entre os dois copos para remover qualquer ar. Em seguida, despeje o gradiente de luz para o copo de volta. </li><li> Ligar o agitador magnético, pressione &quot;spin&quot; na máquina COBE, remova o grampo do tubo que conecta os dois copos, e verifique visualmente se os gradientes pesados ​​e leves são a mistura. </li><li> Uma vez iniciados os gradientes de mistura, ligar a centrífuga. Espere um minuto, e depois ligar a bomba para carregar os gradientes de mistura. </li><li> Para carregar o tecido deixa o gradiente escassear no copo da frente, mas não baixa o suficiente para permitir que o ar a entrar no tubo de carga, então reclamp o tubo que liga os copos e carregar o tecido. </li><li> Continue adicionando o resto do tecido. Em seguida, lave o tubo que mantinha o tecido com 50 ml de solução de lavagem, e usá-lo para lavar o copo da frente. </li><li> Como o último do tecido entra no saco, simultaneamente parar a bomba, unclamp na cabeça da bomba e pinça tubagens acima do saco. Continuar a centrifugar por 5 minutos. </li><li> Enquanto continua a centrifugação, trazer os 12 tubos de coleta para a capa e afrouxe suas tampas. Conecte o tubo de coleta para o tubo amarelo, e colocar a ponta de coleta estéril em um tubo cônico. Então unclamp o tubo amarelo, e prender o tubo verde. </li><li> Quando termina a rodada, levante lentamente Superout a 100. Coletar em tubo de 150 ml 1. Em seguida, coletamos 30 ml em tubos de 2-12 (200-230 ml). </li><li> Uma vez que coleção é completa, pressione &quot;STOP&quot; no COBE. Agora que terminou de purificação, as ilhotas podem ser avaliados e cultura. </li></ol> 2. Amostragem e cultura <ol><li> Depois de coletar as frações purificadas ilhotas, retirar uma amostra de cada um dos 12 tubos de coleta e mancha com Ditizona. A coloração vai mostrar quais são as camadas contêm ilhotas de alta pureza versus camadas com ilhotas de baixa pureza. </li><li> Recolher as tecido de alta pureza e baixa e piscina de cada conjunto. </li><li> Spin e lavar duas vezes. Depois da segunda lavagem, reduzir o volume de cada um para 250 ml com a mídia Wash Final. </li><li> Para avaliar a frações pooled começar por tomar duas amostras de 1 ml do alto das frações agrupadas e uma amostra de 1 ml da baixa. Transferência de cada amostra de 1 ml para um tubo cônico contendo 9 ml de solução de lavagem. </li><li> Em seguida, transferir 1 ml de cada tubo de 15 ml a um prato de contagem. Examinar e contar as células ao microscópio. </li><li> Após a contagem das células calcular o número de frascos necessários à cultura das ilhotas usando a seguinte fórmula: (EIN total / pureza de ilhotas em decimal) / (30.000 EIN por frasco). Por exemplo, 100 mil ilhotas com pureza de 90% são cultivadas em 4 frascos. </li><li> Transferir os ilhéus para T175 frascos e cultura num 37 ˚ C e 5% CO 2 incubadora. </li></ol>

<ol>
	<li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen.">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li><li>Nano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+isolation+for+allotransplantation:+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function.">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li><li>Barbaro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient.">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li><li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance.">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li><li>Fridell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation.">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li><li>Potdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation.">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li><li>Salehi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution.">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li><li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+islet+isolation+from+human+pancreas.">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).</li><li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+isolation+assessment+in+man+and+large+animals.">Islet isolation assessment in man and large animals.</a> Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).</li></ol>

Apesar de avanços significativos nas técnicas de isolamento de ilhotas humanas, o rendimento de ilhotas permanecem altamente variável e imprevisível. Purificação do tecido pancreático digeriu é crucial para recuperar uma massa isle suficiente após digestão enzimática de sucesso para transplante. O método de purificação UIC é recomendado porque uma recuperação superior de alta pureza ilhotas humanas foi demonstrada usando este método. Além disso, até 50 ml de tecido digerido pode ser carregado em uma ...

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>424803</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cobe 2991 Cell Processor</td>
<td>equipment</td>
<td>Gambro. BCT</td>
<td>2556</td>
<td>islet purification</td>
</tr>
<tr>
<td>MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1</td>
<td>equipment</td>
<td>Leica Diagnostic Instrument Co</td>
<td>4103</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell Culture Dish with 2 mm Grid</td>
<td>equipment</td>
<td>Nunc Brand Products</td>
<td>174926</td>
<td>islet counting</td>
</tr>
<tr>
<td>Digital Sight DS L1</td>
<td>equipment</td>
<td>Nikon</td>
<td>217267</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>COBE bag</td>
<td>disposable equipment</td>
<td>O.R. Solution</td>
<td>66707003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T175 culture flask</td>
<td>disposable equipment</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>83.1812.500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>University of Wisconcin (UW) solution</td>
<td>reagent</td>
<td>DURAMED</td>
<td>1000-46-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
<td>reagent</td>
<td>Mediatech Inc</td>
<td>99-597-CM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ficoll 1.100</td>
<td>reagent</td>
<td>Bichrom AG</td>
<td>L6155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>M199 media (wash solution)</td>
<td>reagent</td>
<td>Mediatech Inc</td>
<td>99-784-CM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Final wash/Culture Medium</td>
<td>reagent</td>
<td>Mediatech Inc</td>
<td>99-785-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithizone</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma </td>
<td>D5130</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

human pancreatic islet isolation: part ii: purification and culture of human islets

Gestão da diabetes tipo 1 é onerosa, tanto para o indivíduo ea sociedade, custando mais de 100 bilhões de dólares anualmente. Apesar do uso generalizado de monitoramento de glicose e insulina novas formulações, muitas pessoas ainda desenvolvem devastadoras complicações secundárias. Transplante de ilhotas pancreáticas pode restaurar controle quase normais de glicose em pacientes diabéticos<sup&gt; 1</sup&gt;, Sem o risco de graves episódios de hipoglicemia que estão associados com a terapia insulínica intensiva. Fornecimento de massa de ilhotas suficiente é importante para o transplante de ilhotas bem sucedido. No entanto, as características do doador, a colheita de órgãos e preservação afetar o resultado de isolamento<sup&gt; 2</sup&gt;. Na University of Illinois at Chicago (UIC), desenvolvemos um protocolo de isolamento bem sucedido com um gradiente de purificação melhorou<sup&gt; 3</sup&gt;. O programa foi iniciado em Janeiro de 2004 e mais de 300 isolamentos foram realizados até novembro de 2008. O pancreata foram enviados em soluções frias de conservação (UW, University of Wisconsin ou HTK, histidina-triptofano Ketoglutarate)<sup&gt; 07/04</sup&gt; Para o Laboratório de Isolamento Celular na UIC para isolamento de ilhotas. Ilhotas pancreáticas foram isolados utilizando o método de UIC, que é uma versão modificada do método originalmente descrito por Ricordi<em&gt; Et al</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;. Conforme descrito na Parte I: Digestão e Coleta de tecido pancreático, do pâncreas humano foi aparado, canulados, perfundidos, e digerido. Após a coleta e pelo menos 30 minutos de incubação em solução UW, o tecido foi colocado no separador de células (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) para a purificação<sup&gt; 3</sup&gt;. Purificação seguintes, o rendimento de ilhotas (expressos como equivalentes de ilhotas, IEQ), volume de tecido, e pureza foi determinada de acordo com métodos padronizados<sup&gt; 9</sup&gt;. Ilhotas isoladas foram cultivadas em CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), suplementado com 1,5% de albumina humana, 0,1% de insulina-transferrina-selênio (ITS), 1 ml de Ciprofloxacina, 5 ml de HEPES 1M, e 14,5 ml de 7,5% em Bicarbonato de Sódio T175 frascos a 37 ° C a cultura durante a noite antes ilhotas foram transplantados ou usado para a pesquisa.

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Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Alcançar alta qualidade e quantidade adequada de ilhotas humanas é um dos pré-requisitos importantes para o transplante de ilhotas bem sucedido. Neste vídeo, descrevemos passo a passo os procedimentos para o isolamento de ilhotas pancreáticas humanas (parte II: purificação e cultura de ilhotas humanas) utilizando um método modificado automatizado.

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte II: Purificação e Cultura de Ilhotas Humanos

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

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15.3K visualizações.  University of Illinois, Chicago. Alcançar alta qualidade e quantidade adequada de ilhotas humanas é um dos pré-requisitos importantes para o transplante de ilhotas bem sucedido. Neste vídeo, descrevemos passo a passo os procedimentos para o isolamento de ilhotas pancreáticas humanas (parte II: purificação e cultura de ilhotas humanas) utilizando um método modificado automatizado.