Supportato da fondazione presso la University of Illinois a Chicago, nonché delle cellule insulari Resource Center NIH di sovvenzione (RFA-RR 05-003), la Fondazione Cristoforo, la Fondazione Efroymson, e la Fondazione Tellabs.

1. Purificazione di isolotti <ol><li> Per avviare la procedura di purificazione isolotto, caricare la borsa COBE, morsetto tutti i tubi, tranne il tubo verde, e impostare la velocità di 1.500 e il super fuori a 0. </li><li> Nel cofano impostare la pompa e bicchieri gradiente e collegare il tubo di raccolta al tubo verde. </li><li> Ora il caricamento del Ficoll 1,100 può iniziare: spingere &quot;spin&quot;, quindi aggiungere 110 ml di Ficoll 1,100 al bicchiere davanti, e avviare la pompa per caricare il sacchetto COBE. Mentre il Ficoll è caricato, premere super-out, fermare la pompa, sbloccaggio la testa della pompa e impostare la super velocità verso 100. </li><li> Quando il Ficoll raggiunge il bicchiere e tutta l&#39;aria viene espulsa dai, tubi ri-clamp a testa della pompa. Impostare la velocità di rotazione a 3.000, e la velocità fuori super 0. </li><li> Ora si preparano a caricare le pendenze versando il gradiente pesante nel becher anteriore. Leggermente rilasciare la pinza tra i due bicchieri per rimuovere l&#39;aria. Versare quindi il gradiente di luce nel becher schiena. </li><li> Accendere l&#39;agitatore magnetico, premere &quot;girare&quot; sulla macchina COBE, rimuovere la pinza dal tubo che collega i due bicchieri, e verificare visivamente che i gradienti pesanti e leggeri sono miscelazione. </li><li> Una volta iniziate le pendenze di miscelazione, accendere la centrifuga. Attendere un minuto, quindi accendere la pompa per caricare il gradienti di miscelazione. </li><li> Per caricare il tessuto lasciare che il gradiente di esaurirsi nel bicchiere davanti, ma non sufficientemente basso per permettere all&#39;aria di entrare nel tubo di carico, poi reclamp il tubo di collegamento alla bicchieri e caricare il tessuto. </li><li> Continuare ad aggiungere il resto del tessuto. Quindi lavare il tubo che tiene il tessuto con 50 ml di soluzione di lavaggio, e utilizzarla per lavare il bicchiere davanti. </li><li> Come l&#39;ultimo del tessuto entra nella borsa, allo stesso tempo fermare la pompa, sbloccaggio alla testa della pompa, pinza e tubo sopra il sacchetto. Continuare a centrifugare per 5 minuti. </li><li> Mentre centrifugazione continua, portare il 12 tubi di raccolta alla cappa e allentare i loro berretti. Collegare il tubo di raccolta al tubo giallo e posizionare la punta sterile raccolta nel tubo conico 1. Poi sbloccaggio del tubo giallo, e bloccare il tubo verde. </li><li> Quando il giro finisce, sollevare lentamente Superout a 100. Raccogliere 150 ml in tubo 1. Poi raccogliere in provette da 30 ml 2-12 (200-230 ml). </li><li> Una volta che la raccolta è completa, premere &quot;STOP&quot; sulla COBE. Ora che la purificazione è finita, le isole possono essere valutati e colto. </li></ol> 2. Campionamento e cultura <ol><li> Dopo aver raccolto le frazioni purificate isolotti, rimuovere un campione da ciascuno dei 12 tubi di raccolta e la macchia con ditizone. La colorazione mostrerà quali sono strati contenenti isolotti di elevata purezza vs strati con isolotti bassa purezza. </li><li> Raccogliere il tessuto ad alta purezza e bassa e la piscina ogni insieme. </li><li> Spin e lavare due volte. Dopo il secondo lavaggio, portare il volume di ciascuna a 250 ml con i media lavaggio finale. </li><li> Per valutare le frazioni in pool inizia prendendo due campioni da 1 ml dall&#39;alto delle frazioni messe in comune e un 1 ml di campione dal basso. Trasferire 1 ml di ogni campione in una provetta conica contenente 9 ml di soluzione di lavaggio. </li><li> Poi trasferire 1 ml da ciascuna provetta 15 ml di un piatto di conteggio. Esaminare e contare le cellule al microscopio. </li><li> Dopo il conteggio delle cellule calcolare il numero di flaconi necessari per cultura gli isolotti con la seguente formula: (EIN totale / purezza di isolotti in decimale) / (30.000 EIN per cilindro). Per esempio, 100.000 isole con il 90% di purezza sono coltivate in 4 fiaschi. </li><li> Trasferire le isolette di T175 fiaschi e cultura in un 37 ˚ C e 5% CO 2 incubatore. </li></ol>

<ol>
	<li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen.">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li><li>Nano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+isolation+for+allotransplantation:+variables+associated+with+successful+islet+yield+and+graft+function.">Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function.</a> Diabetologia. 48, 906-912 (2005).</li><li>Barbaro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+human+pancreatic+islet+purification+with+the+refined+UIC-UB+density+gradient.">Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient.</a> Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).</li><li>Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreas+preservation+prior+to+islet+isolation.+Cold+ischemic+tolerance.">Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance.</a> Transplantation. 59, 689-694 (1995).</li><li>Fridell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+and+University+of+Wisconsin+solution+for+organ+preservation+in+clinical+pancreas+transplantation.">Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation.</a> Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).</li><li>Potdar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+experience+using+histidine-tryptophan-ketoglutarate+solution+in+clinical+pancreas+transplantation.">Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation.</a> Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).</li><li>Salehi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+islet+isolation+outcomes+from+pancreata+preserved+with+Histidine-Tryptophan+Ketoglutarate+versus+University+of+Wisconsin+solution.">Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution.</a> Transplantation. 82, 983-985 (2006).</li><li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+islet+isolation+from+human+pancreas.">Automated islet isolation from human pancreas.</a> Diabetes. 38 Suppl 1, 140-142 (1989).</li><li>Ricordi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+isolation+assessment+in+man+and+large+animals.">Islet isolation assessment in man and large animals.</a> Acta Diabetol Lat. 27, 185-195 (1990).</li></ol>

Nonostante significativi progressi nelle tecniche di isolamento delle isole umana, resa isolotto rimangono estremamente variabile e imprevedibile. Purificazione del tessuto pancreatico digerito è fondamentale per recuperare una sufficiente massa isola dopo il successo digestione enzimatica per il trapianto. Il metodo di purificazione UIC è raccomandato farlo poiché un recupero superiore di isole umane ad alta purezza è stato dimostrato utilizzando questo metodo. Inoltre, fino a 50 ml di tessuto digerito possono esse...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>equipment</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>424803</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cobe 2991 Cell Processor</td>
<td>equipment</td>
<td>Gambro. BCT</td>
<td>2556</td>
<td>islet purification</td>
</tr>
<tr>
<td>MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1</td>
<td>equipment</td>
<td>Leica Diagnostic Instrument Co</td>
<td>4103</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell Culture Dish with 2 mm Grid</td>
<td>equipment</td>
<td>Nunc Brand Products</td>
<td>174926</td>
<td>islet counting</td>
</tr>
<tr>
<td>Digital Sight DS L1</td>
<td>equipment</td>
<td>Nikon</td>
<td>217267</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>COBE bag</td>
<td>disposable equipment</td>
<td>O.R. Solution</td>
<td>66707003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T175 culture flask</td>
<td>disposable equipment</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>83.1812.500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>University of Wisconcin (UW) solution</td>
<td>reagent</td>
<td>DURAMED</td>
<td>1000-46-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hank's Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
<td>reagent</td>
<td>Mediatech Inc</td>
<td>99-597-CM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ficoll 1.100</td>
<td>reagent</td>
<td>Bichrom AG</td>
<td>L6155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>M199 media (wash solution)</td>
<td>reagent</td>
<td>Mediatech Inc</td>
<td>99-784-CM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Final wash/Culture Medium</td>
<td>reagent</td>
<td>Mediatech Inc</td>
<td>99-785-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dithizone</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma </td>
<td>D5130</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

human pancreatic islet isolation: part ii: purification and culture of human islets

Gestione del diabete di tipo 1 è onerosa, sia per l&#39;individuo e la società, che costano oltre 100 miliardi di dollari all&#39;anno. Nonostante l&#39;uso diffuso di monitoraggio della glicemia e insulina formulazioni nuove, molte persone ancora sviluppare devastanti complicanze secondarie. Trapianto di isole pancreatiche in grado di ripristinare nei pressi di controllo normale del glucosio in pazienti diabetici<sup&gt; 1</sup&gt;, Senza il rischio di gravi episodi di ipoglicemia che sono associati con la terapia insulinica intensiva. Fornire sufficiente massa isolotto è importante per il trapianto di isole pancreatiche di successo. Tuttavia, le caratteristiche del donatore, reperimento di organi e la conservazione influenzare l&#39;esito isolamento<sup&gt; 2</sup&gt;. Presso l&#39;Università dell&#39;Illinois a Chicago (UIC), abbiamo sviluppato un protocollo di successo isolamento con pendenza purificazione migliorato<sup&gt; 3</sup&gt;. Il programma è iniziato nel gennaio 2004 e più di 300 isolamenti sono stati effettuati fino a novembre 2008. Il pancreas sono stati inviati nelle soluzioni di conservazione a freddo (UW, University of Wisconsin o HTK, Istidina, Triptofano chetoglutarato)<sup&gt; 4-7</sup&gt; Al Laboratorio cella d&#39;isolamento a UIC per l&#39;isolamento delle isole. Isole pancreatiche sono stati isolati con il metodo UIC, che è una versione modificata del metodo originariamente descritto da Ricordi<em&gt; Et al</em&gt;<sup&gt; 8</sup&gt;. Come descritto nella Parte I: Digestione e raccolta di tessuto pancreatico, pancreas umano è stato tagliato, cannulata, perfusi e digerito. Dopo la raccolta e almeno 30 minuti di incubazione in soluzione UW, il tessuto è stato caricato nel separatore cellulare (COBE 2991, Cobe, Denver, CO) per la depurazione<sup&gt; 3</sup&gt;. A seguito di purificazione, resa isolotto (espressi come equivalenti isolotto, IEQ), il volume dei tessuti, e la purezza è stato determinato in base ai metodi standard<sup&gt; 9</sup&gt;. Isolette isolate sono state coltivate in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), integrati da 1,5% di albumina umana, 0,1% insulina-transferrina-selenio (ITS), 1 ml di Ciprofloxacina, 5 ml di HEPES 1M, e 14,5 ml di Bicarbonato di Sodio 7,5% nel T175 matracci a 37 ° C durante la notte prima cultura isolotti sono stati trapiantati o utilizzati per la ricerca.

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Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Il raggiungimento di alta qualità e la quantità appropriata di isole umane è uno dei presupposti importanti per il trapianto di isole pancreatiche di successo. In questo video, si descrive passo dopo passo le procedure per l&#39;isolamento delle isole pancreatiche umane (parte II: la purificazione e la cultura di isole umane) utilizzando un metodo modificato automatizzato.

Isolamento del pancreas umano Islet: Parte II: La purificazione e la cultura di isole umane

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

human-pancreatic-islet-isolation-part-ii-purification-culture-human

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Biology

15.3K Views.  University of Illinois, Chicago. Il raggiungimento di alta qualità e la quantità appropriata di isole umane è uno dei presupposti importanti per il trapianto di isole pancreatiche di successo. In questo video, si descrive passo dopo passo le procedure per l'isolamento delle isole pancreatiche umane (parte II: la purificazione e la cultura di isole umane) utilizzando un metodo modificato automatizzato.