Este protocolo gera dados de transcrição de alto rendimento de células ilhotas humanas individuais, que podem ser usadas para estudar heterogeneidade de células anocromáticas, identificar tipo de célula rara e regulação genética em doenças. Esta técnica gera dados de células únicas em maior escala, é fácil de usar e tem tempo de processamento bastante curto. Este método pode ser aplicado a ilhotas de outras espécies e traçar outros tecidos recém-isolados.
No entanto, o protocolo precisa ser otimizado para atender aos procedimentos de dissociação específicos do tecido. É fundamental preparar células dissociadas de alta qualidade. QC da suspensão celular antes do particionamento de célula única é fundamental, assim como lidar com a emulsão com cuidado e rapidez.
Alguns pontos de verificação de qualidade como saber se um chip entupiu são melhor vistos do que lidos. Depois de obter ilhotas humanas e incubar durante a noite, conte e adoeite 200 a 300 ilhotas usando uma pipeta P200. Transfira as ilhotas para um tubo cônico de 15 milímetros contendo cinco milímetros de mídia completa de ilhotas, pré-aquecidas a 37 graus Celsius.
Coloque o tubo em uma centrífuga a 200 vezes G por dois minutos. Aspire suavemente o supernatante sem perturbar a pelota na parte inferior. Adicione um milímetro de solução de dissociação celular pré-aquecida e interrompa a pelota ao escoar suavemente para cima e para baixo.
Incubar as ilhotas a 37 graus Celsius por 9 a 11 minutos. A cada três minutos, pipeta para cima e para baixo lentamente por 10 segundos para dissociar as células em células únicas. Uma vez que as células ilhotas estejam bem dissociadas e a solução fique nublada, adicione nove mililitros de mídia completa de ilhotas e filtre através de um filtro de célula de 30 micrômetros em um novo tubo cônico de 15 milímetros.
Colete as células por centrifugação a 400 vezes G durante cinco minutos. Aspire o supernascer e suspenda a pelota celular em 200 a 300 microliters de 1X PBS 04% BSA solução. Agora, misture 10 microliters da cultura celular com 0,5 microliters de AO/DAPI.
Pipeta para cima e para baixo para misturar bem. Carregue 10,5 microliters em um slide e execute o ensaio de contagem de células em um contador automatizado de células baseado em fluorescência para determinar a contagem e a viabilidade. Coloque um chip microfluido em uma caixa de chip.
Oriente a caixa do chip, garantindo que os poços de petróleo estejam mais próximos da pessoa que realiza o experimento. Use uma pipeta para adicionar o volume calculado de células nas tiras de tubo preparadas. Pipeta para misturar cinco vezes.
Sem descartar as pontas da pipeta, transfira 90 microliters de mistura celular para remar um do chip. Espere por 30 segundos, depois pipeta muito lentamente para carregar 40 microliters de contas de gel para a linha dois. Dispense 270 microliters de óleo particionário para os poços da linha três.
Enganque a junta de chip nas abas do suporte do chip. Coloque o suporte do chip montado no dispositivo de particionamento de célula única e pressione o botão de execução. Após a conclusão da execução, remova a junta do chip do suporte, abra a caixa do chip em um ângulo de 45 graus e transfira 100 microliters da emulsão do chip para um poço em uma placa de plástico azul 65.
Dispense 125 microliters de emulsão rosa quebrando reagente em cada emulsão. Espere por um minuto, depois transfira todo o volume de cada poço para cada tubo de 0,2 mililitro. Certifique-se de que há uma camada de claro e uma camada de rosa na tira do tubo.
Com uma pipeta, remova 125 microliters da camada rosa da parte inferior da tira do tubo sem perturbar a camada clara. É normal que um pequeno volume de aproximadamente 15 microliters da camada rosa permaneça no tubo. Em seguida, adicione 200 microliters de mistura de limpeza a cada uma das tiras do tubo e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos.
Transfira as tiras do tubo para um suporte magnético e espere dois minutos para permitir que a solução seja limpa. Remova o supernatante e descarte. Em seguida, lave as contas com 80% de etanol duas vezes.
Deixe as contas secarem por um minuto. Remova as tiras do tubo do ímã e adicione 35,5 microliters de solução de elução às contas. Pipeta para suspender as contas na solução e incubar por dois minutos em temperatura ambiente.
Transfira as tiras do tubo para um suporte magnético e permita que a solução se limpe. Transfira o DNA complementar purificado das tiras do tubo para limpar tiras de tubo de 0,2 mililitro. Para amplificar o DNA complementar, adicione primeiro 65 microliters de amplificação de DNA complementar em cada amostra.
Coloque as tiras do tubo em um termociclador e execute o programa de acordo com o manuscrito. As amostras podem ser armazenadas a quatro graus Celsius por até 72 horas. Após normalizar o DNA complementar a 15 anagramas e 20 microliters, alíquota 30 microliters de tagmentação se misturam a cada amostra complementar de DNA no gelo.
Coloque as amostras no termociclador e execute o protocolo de tagmentação a 55 graus Celsius por cinco minutos, diminuindo para 10 graus Celsius e segure. Em seguida, adicione 60 microliters de índice amostral PCR Master Mix e 10 microliters de 20 micromolars indicador de amostra de forolegol à amostra de DNA complementar purificada de 30 microliteres. Devolva os tubos ao termociclador para amplificar o produto final da biblioteca.
Normalize cada amostra com água a dois nanogramas por microlitera e puxe três microliters de cada amostra normalizada juntos em um tubo de 1,5 mililitro. Piscina diluída com tampão de elução para 0,25 nanogramas por microliter. Desnaturar a piscina combinando 12 microlitadores da amostra de piscina diluída, um microliter de um animal ou controle de DNA, dois microliters de tampão de elução, e cinco microliters de 0,4 hidróxido de sódio normal.
Incubar a mistura por cinco minutos, depois adicionar 10 microliters de 200 mililitros Tris em pH8 e carregar 4,05 microliters da mistura em 1345,95 microliters de HTA-1. Em seguida, carregue 1,3 mililitros no cartucho do sequenciador e execute de acordo com as diretrizes do fabricante usando uma receita de sequenciamento. No computador, execute o Cell Ranger para des multiplex arquivos de chamada base bruta gerados pelo sequenciamento em arquivos FASTQ.
Alinhe arquivos FASTQ ao conjunto de genomas humanos b37.3 e use o modelo genético CSC para obter quantificação de expressão. Examine o gráfico de classificação de código de barras para ter certeza da separação dos códigos de barras associados às células e do fundo. Para controlar a qualidade celular, exclua células com menos de 500 genes detectados, menos de 3.000 números totais de identificadores moleculares únicos e maiores que 0,2 escore de viabilidade.
Ajuste os cortes de acordo com os tipos de tecido e células. Em seguida, use mclust pacote R para remover células que expressam mais de um gene hormonal. Use o seurat do pacote R para normalizar a expressão genética pelos identificadores moleculares únicos totais e multiplicar por um fator de escala de 10.000 no nível celular.
Em seguida, detecte genes variáveis usando a expressão média e dispersão de todas as células. Ajuste os cortes de acordo com os tipos de tecido e células. Realize a análise dos componentes principais com os genes variáveis.
Células de cluster com um número selecionado de componentes principais. Derivam genes enriquecidos por aglomerados de células comparando um aglomerado de células com o resto das células. Neste protocolo de sequenciamento de RNA de célula única, as ilhotas humanas adquiridas foram primeiramente dissociadas como validadas pelas células alfa e beta na fluorescência de RNA e hibridização C2.
Um exemplo bem sucedido de emulsão após a etapa de particionamento mostra uma solução pálida e nebulosa uniforme com óleo de particionamento mínimo separado das contas de gel. Em contraste, uma emulsão de má qualidade com separação de fase clara entre as contas de gel e o óleo pode ser devido a um entupimento durante a execução do chip. Após amplificação complementar do DNA, uma distribuição representativa do tamanho de um fragmento mostra o pico típico para uma amostra de DNA complementar de boa qualidade residiu perto de 1.000 a 2.000 pares de base.
O pico perto de 600 pares de bases foi específico para DNA complementar de ilhotas. A distribuição em tamanho de fragmento para as bibliotecas de sequenciamento de RNA foi entre 300 e 500 pares base. A análise de agrupamento revelou 12 tipos de células no espaço das dimensões de incorporação do vizinho estocástico distribuídos em T.
Três subsu populações em células alfa e quatro em células beta foram reveladas. Essa técnica permite que os pesquisadores construam ilhotas celulares abrangentes para ilhotas humanas. Com mais dados de doadores não diabéticos e diabéticos, é usado como recurso para descoberta de alvos terapêuticos.
