Este trabalho foi financiado pelo alemão National Science Foundation (DFG) e pelo Instituto Federal de Avaliação dos Riscos (BfR, Alemanha).

Os mais de todo o design do protocolo contendo quatro etapas principais é ilustrada na Figura 1. Todas as etapas são descritas em pormenor. Isolamento de células transdução, e da cultura, seguido por imagem confocal cerca de 24 horas depois é uma escala de tempo consecutivos e obrigatórios. A construção de vírus deve ser feito antes do isolamento de células e é então utilizado para a transdução genética. 1. Isolamento de miócitos cardíacos adultos de coração de rato <ol><li> Ratos Wistar machos adultos, aproximadamente 250 g de peso (6-12 semanas de idade) estão anestesiados por injeção intraperitoneal de 170 mL de solução anestesia por 100 g de peso corporal </li><li> Além disso, uma solução de citrato (2 mL / g peso corporal) é injetado para evitar a coagulação do sangue durante a cirurgia. </li><li> Langendorff Perfusão Set-Up deve estar preparado. Todas as soluções devem ser saturada com oxigênio. </li><li> Quando o rato é anestesiados, o animal é fixado em uma placa de cirurgia e na parte superior do corpo é desinfetada com álcool 70%. </li><li> O animal é morto cortando a carótida. </li><li> O tórax é aberto com uma tesoura. O coração ea aorta agora deve ser acessível. O Pericard é removido. </li><li> Gelada solução A + (5 ml) é injetado em ambos os ventrículos utilizando uma agulha de 26 gauge para prender o coração e lavar o sangue. </li><li> A aorta é agarrado com uma pinça e truncado no arco aórtico foram apenas a ramificação ocorre pela primeira vez. </li><li> O coração é removido do peito e da aorta é acoplada a uma cânula de perfusão set-up por fórceps e uma braçadeira para permitir a perfusão retrógrada Langendorff. Esteja ciente de que não foraminate as válvulas da aorta. </li><li> O coração precisa ser corrigido por uma ligadura ao redor da aorta / cânula. Vasos abertos também precisa ser ligada. </li><li> O coração é retrogradamente perfundidos com oxigênio saturado de solução A + à temperatura ambiente (23 ° C) por 10 min a uma pressão de cerca de 70 mbar. Verifique se não há bolhas de ar entrar na aorta. </li><li> A solução de perfusão é ligado a uma solução Liberase a uma temperatura de 37 ° C por aproximadamente 25 min a uma taxa de 4 ml / min por meio de uma bomba peristáltica. No final da perfusão do coração deve olhar em mármore branco. O tempo de digestão pode ter de ser adaptados à condição situação / tecido. </li><li> O coração é retirado da perfusão set-up e colocado em uma solução contendo uma placa de Petri a uma temperatura de 37 ° C. Restantes navios e átrios são cortadas. Os vasos são descartados e os átrios - se necessário - são tratados de forma diferente (não faz parte desse protocolo). Os ventrículos são divididos em cerca de 6 peças. </li><li> As peças são transferidas para um Erlenmeyer de 100 ml contendo 20 ml de solução A, a uma temperatura de 37 ° C e um pouco agitada em banho-maria a 37 ° C por 5 min. Finalmente, o sobrenadante é descartado. </li><li> O procedimento descrito acima é repetido uma ou duas vezes. O sobrenadante deve aparecer ligeiramente opaca. </li><li> O incremento da concentração de cálcio extracelular é iniciada pela adição de 20 ml de solução B 1 / 2 a 37 ° C para as células e tecido remanescente residual de uma solução A no Erlenmeyer. Isso é um pouco abalada em um banho de água 37 ° C para um adicional de 5 min. Posteriormente, o sobrenadante é descartado. </li><li> Adicionar mais 20 ml de solução B 02/01. (O sobrenadante solução / agora deve conter células viáveis.) A queda das células é transferido para uma placa de Petri em um microscópio invertido de cultura de células. Se as células apresentam uma alta atividade espontânea (contrações) é preciso esperar até que as células vêm para descansar. </li><li> Mais uma vez o sobrenadante é descartado e 20 ml de solução B 02/01 são adicionados. </li><li> A ponta de uma pipeta Pasteur de plástico é cortado de tal forma que as peças de tecido pode passar facilmente quando agitado pela abertura. Com o tratamento chama arestas são suavizadas (derretida). </li><li> Agora as peças de tecido são ligeiramente e triturado. As peças de tecido devem &quot;desmoronar&quot; nas células. </li><li> A célula que contém o sobrenadante é decantado e diluído com solução B para atingir a densidade de célula desejada, o que depende do tipo de experiências e deve ser determinada empiricamente. </li></ol> 2. Construção de um adenovírus para a transdução de proteína de fusão Para produzir o adenovírus Transpose-Ad Sistema vetor adenoviral de Biomedicals MP é utilizado 1. Este protocolo inicia-se com o vetor de entrada disponíveis e testadas (pCR259) para uma proteína de fusão fluorescentes ou 2 s GEB. <ol><li> Um montante de 10 ng dos acima mencionados pCR259 vetor inicial contendo o gene de interesse é transformada com 100 l HighQ-1-AD Transpose ™ 294 células competentes. </li><li> Esta mistura é incubada por 20 min no gelo seguido por um choque térmico durante 45 s em 42 ° C e armazenadas em gelo por um adicional de 2 min. </li><li> Adicionar 900 &amp; mu; L de seletivo C LB médio e crescer a 37 ° com agitação suave por 4 horas. </li><li> ML placa 50, 100 ml e 200 mL em placas contendo LB médio com cloranfenicol (Cm, 20 mcg / ml), Ampicilina (100 mg / ml), tetraciclina (15 mcg / ml), X-Gal (280 mg / ml ) e IPTG (40 mcg / ml). (A coloração mais intensa e mais rápida azul é possível usando o corante mais caro Bluo-Gal com 300μg/ml. Isso deve ser usado em particular quando você não está tão familiar em reconhecer e distinguir azul / branco colônias) </li><li> Crescer durante 24 horas a 37 ° C. Deixe a 4 ° C até a identificação de boas colônias azuis é possível. Quando há problemas para decidir qual é verdadeiramente colônia branca escolher algumas das colônias e replicar em outro prato contendo os três antibióticos, X-Gal e IPTG e deixá-los crescer durante a noite a 37 ° C. Observação) O HighQ-1-AD Transpose ™ 294 células contêm dois plasmídeos importantes: A espinha dorsal adenovírus (Transposição-Ad ™ 294) e um ajudante plasmídeo expressando uma transposase, que media a inserção do gene de interesse em sites de seu alvo, localizado no gene LacZ dos 294 Transpose-AD plasmídeo. </li><li> Para identificar as colônias positivas contendo o gene de interesse em realizar a espinha dorsal do vírus colônia-PCR, conforme descrito no 2,7-2,9. Use primers do vetor que flanqueiam o sítio múltiplo de clonagem (forward 5 &#39;CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG 3&#39;, inverta 5 &#39;GCGGATAACAATTTCACACAGG 3&#39;) e fazer uma colônia PCR com 100% de colônias brancas e usar uma colônia de azul como um controle para plasmídeos 294 Transpose-AD sem gene inserido de interesse. Colônias azuis lhe dará um fragmento de PCR de curta duração (~ 200bp), colônias contendo o gene de interesse mostrar um produto PCR de grande porte (dependendo do comprimento de seu gene de interesse) e as colônias com dois fragmentos são colônias de células múltiplas e têm de ser separados se ainda mais utilizado. </li><li> Acordo com a tabela abaixo de um mix mestre precisa ser preparado. </li><li> Escolha uma colônia de 100% só branca com um palito de dentes autoclavados e primeiro fazer uma replica dessa colônia em uma placa de LB com Cm. </li><li> Transferência da colônia para a PCR-mix. Twirl-lo no PCR-mix 3-4 vezes do que retire o palito antes que pudesse absorver um monte de PCR-mix. A PCR-protocolo depende do kb da inserção e da polimerase usada. A temperatura de anelamento dos primers é de 57 ° C e um uso de 35 ciclos é recomendado. </li><li> Crescer ao longo culturas noite (LB médio com Cm) dos clones positivos e isolar os plasmídeos com um kit comercial disponível sem colunas de rotação, porque a força centrífuga perturba o vetor do vírus enorme. </li><li> Transformar a 0,5 mg de plasmídeos isolados em 100 l DH5α células competentes. Incubar DNA com as células no gelo por 30 min. De choque térmico 45 s a 42 ° C e definir em gelo por 2 min. </li><li> Adicionar 900 mL seletivo LB médio e crescer a 37 ° C com agitação suave durante 1 hora. </li><li> Placa de 50 ul em uma placa contendo LB médio com Cm, X-Gal e IPTG. Incubar a 37 ° C por 24 horas. </li><li> Escolha e replicar até 20% de 100 colônias brancas em separado Ampicilina, Tetraciclina e cloranfenicol placas contendo IPTG e X-Gal. Deixá-los crescer durante a noite a 37 ° C. Selecionar as colônias que são 100% branco, cloranfenicol resistente, ampicilina e tetraciclina sensíveis. </li><li> Colônia-PCR (opcional): clones positivos podem ser testados novamente com colônia-PCR para verificar se eles contêm a inserção. </li><li> Escolha uma única colônia de um recombinante positiva e crescer em 600 ml de LB médio com Cm. </li><li> Isolar o plasmídeo usando um kit maxi plasmídeo. </li><li> Digest mg 5 de plasmídeo com Pac I por duas horas a 37 ° C e parar a reacção a 65 ° C por 20 min. </li><li> Concentrar a digerir toda em um SpeedVac em temperatura ambiente por 30 min para um volume final de 10 ml ou usar um método de extração fenol-clorofórmio. </li><li> Descongelar um frasco de congelados QBI-HEK 293 células com agitação suave em um banho de água 37 ° C. Lavar o exterior do frasco com etanol 70% e proceder de forma asséptica em uma capa estéril. </li><li> Transferência de células para um tubo estéril ml 15, adicionar gota a gota 10 ml DMEM (+10% FCS), enquanto agitar suave e centrifugar 10 min a 250xg para agregar as células. </li><li> Elimine o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 10 ml DMEM (+10% FCS) suavemente pipetando para cima e para baixo. </li><li> Semente em um frasco de 75 cm 2 e adicione 10 ml DMEM com SFB 10% para as células. Incubar durante uma noite a 37 ° C em 5% incubadora de CO 2. </li><li> No dia seguinte, verificar a densidade das células. QBI-HEK 293 células devem ser divididas na proporção 1:10 - 01:20. </li><li> Remova o meio das células e trypsinize com 2 ml de tripsina para min 1-3. Dê 10 ml DMEM para as células e centrifugar a 250xg por 10 min. </li><li> Retire cuidadosamente a médio e dar 10 ml de meio fresco para as células, ressuspender e contagem das células. </li><li> Placa em um de seis, bem, bem com 2x10 5, 3x10 5 </sup&gt;, 4x10 5, 5x10 5 e 6x10 5 células. Incubar o prato a 37 ° C em uma incubadora de CO 2. </li><li> No dia seguinte, use um poço com confluência de 50% a transfecção com o concentrado Pac eu digerir. Temos uma boa experiência com transfecção 2000 Lipofectamine, mas também outros métodos (tais como a transfecção de fosfato de cálcio) deve ser adequado. </li><li> Mudar o meio em 3-4 h bem antes de transfecção para obter as células em crescimento exponencial durante o procedimento. </li><li> Misturar 5 Lipofectamine mL com 250 mL DMEM e incubar em temperatura ambiente por 5 min. </li><li> Dar a Mistura Lipofectamine-Medium ao DNA (Pac I digest) e misturar batendo contra o tubo de reação, não misturando por pipetagem. Incubar a mistura de 20 min em temperatura ambiente. </li><li> Queda da mistura de transfecção para as células e rock a placa para misturar. Incubar a 37 ° C com 5% de CO 2. Alterar meio após 4-5 horas. </li><li> Dois dias depois de tomar o meio de transfecção das células e dá-lo em uma garrafa de cultura fresco (75 cm 2). </li><li> Trypsinize as células com 500 mL de tripsina para até 5 min. Dê 1 ml DMEM para as células, ter toda a mistura e coloque-o, juntamente com 17 ml de meio fresco (DMEM com FCS) para o balão cultura. Cultivar as células a 37 ° C com 5% de CO 2 até efeito citopático (CPE) são visíveis. Veja a Figura 2 para aprender CPE deve ser parecida. </li><li> Coletar as células com o meio em um tubo de 50 ml e congelar as células a -80 ° C. Quebrar as células com três congelamento / descongelamento (-80 ° C/37 · Banho de água C). </li><li> Centrifugar 20 minutos a 8000xg e 4 ° C. Decantar o sobrenadante em um prato 100 milímetros de diâmetro e descartar o pellet. Use um filtro estéril com poros de 0,45 filtrado o sobrenadante. Este é o primeiro vírus de ações (passagem 1). </li><li> Use 1 / 3 deste estoque para transduzir um balão 2 75 centímetros com células HEK-293 QBI com confluência de 70%. Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 até CPE s são visíveis. </li><li> Se as células mostram CPE s coletá-los e extrair o vírus como feito antes. Esta é a passagem 2 do vírus. </li><li> Repita os passos de 2,37 e 2,38 com a passagem do vírus 2 e assim por diante até a amplificação do vírus atinge um estoque suficiente de vírus. O vírus pode ser concentrado, com tubos de centrifugação específicas (Amicon Ultra-15 unidade centrífuga filtro com ultracel-100 a partir de membrana Millipore) e armazenado por vários meses a -80 ° C. Para contar as partículas infecciosas use um ensaio de placa. </li><li> Use a passagem do vírus 2 ou superior a transdução de células e para a amplificação do vírus. </li></ol> 3. Cultura de células primárias e transdução adenoviral <ol><li> Estéril lamínulas redondas de 20 mm de diâmetro são colocados no padrão de 12-lamelas. </li><li> 20 mL de solução ECM é distribuída igualmente em cada lamínula. Restos são descartados. Para secagem de permitir um mínimo de 1 hora a 37 ° C. Em alternativa, o revestimento pode por secas durante a noite (12 h) em temperatura ambiente. </li><li> Cada poço é preenchido com 1 ml Médio M199 com suplementos compreendendo antibióticos e ITS. </li><li> A suspensão de células (do passo 1.21) de 200 a 400 mL é adicionado a cada poço. Cultivo das células ocorre a 37 ° C em 5% incubadora de CO 2. </li><li> Células estão autorizados a sedimentos e após 1 h médio é alterada. </li><li> Imediatamente depois de mudar o meio de uma quantidade adequada de solução contendo o vírus (de passagem 2 ou superior) é misturado-o suavemente a placa. </li><li> No caso de um meio de cultura de longo prazo é trocada a cada 2 dias. </li><li> 24 horas após transfecção expressão GEB é detectável. </li></ol> 4. Imagem confocal para 3D estruturas subcelulares e Ca 2 + Sinalização Imagem confocal pode ser feita em qualquer microscópio confocal. No entanto, o cálcio imagem experimentos requerem uma velocidade de aquisição de pelo menos a taxa de vídeo (25-30 Hz). Isto restringe tecnologias utilizáveis ​​para qualquer scanners de feixe multi (por exemplo disco de Nipkow, varreu campo ou kilo-feixe scanner array) ou o scanner de feixe único muito rápidas (scanner de ressonância por exemplo, ou acústico óptico deflector (AOD), scanner). Para uma visão geral ver ref. 3. A imagem 3D-subcelulares requer um z-drive. Aqui, um scanner série kilo-feixe (VTinfinity, VisiTech Int., Sunderland, Reino Unido) é usado. <ol><li> O microscópio e equipamento periférico deve ser definido em um modo de operação. Especialmente para o laser isso pode exigir um período de aquecimento até uma potência de saída estável é alcançado. </li><li> Células precisam ser transferidos para uma câmara experimental (tampa de deslizamento de transferência). As lamelas com células são transferidas para uma câmara experimental. 1mL solução Tyrode (contendo 1,8 mM de cálcio extracelular) é então adicionado. </li><li> A câmara experimental precisa ser colocado no palco microscópio. Eletrodos de estimulação, a perfusão set-up e ainda mais periféricaral dispositivos, controle de temperatura, por exemplo, precisam ser organizados em conformidade. </li><li> Células será focada em e selecionado usando luz branca e / ou iluminação de epifluorescência. </li><li> Parâmetros de aquisição, tais como potência do laser, etc tempo de exposição ou um protocolo de experimento inteiro precisa ser set-up. </li><li> Imagens de séries temporais e / ou Z-seção podem ser adquiridos. </li><li> Nas medições set-up mais avançada multimodo pode ser feito usando eletrofisiologia (patch-clamp) e / ou manipulação ópticos como a redistribuição de fluorescência após photobleach (FRAP) ou uncaging de substâncias, incluindo dois fotólise fóton. </li><li> Análise de imagem, especialmente a reconstrução 3D é realizada no software de análise dedicada, como Imaris (Bitplane AG, Zürich, Suíça), velocidade (Improvisação, Coventry, Reino Unido) ou Navegador Arivis (arivis GmbH, Rostock, Alemanha). </li></ol> 5. Resultados representativos: Os resultados finais do protocolo são as seqüências de imagens que podem ser usadas para extrair mais dados. Um exemplo é a investigação de estruturas celulares e organelas. A Figura 3 mostra o exemplo da disposição 3-dimensional do aparelho de Golgi. Em contraste com microscopia eletrônica de todas as investigações podem ser realizadas em células vivas. <img src="/files/ftp_upload/1433/JoVEFig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Fluxo Geral dos principais passos experimentais. <img src="/files/ftp_upload/1433/JoVEFig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: A imagem da esquerda mostra as células HEK-Q, em cultura, com confluência de 90-95% que não são transduzidas. Efeitos citopático após a transdução viral são mostradas na parte direita. Células redondas e retire-se do fundo da placa. Nessas células o núcleo ocupa a maior parte das células como resultado de produção de vírus ativo. <img src="/files/ftp_upload/1433/JoVEFig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: miócito cardíaco de ratos adultos transfectadas com uma proteína de fusão YFP-targeting o aparelho de Golgi. Miócitos cardíacos após a transferência de genes adenovirais (um dia na cultura) expressar a proteína de fusão fluorescente. Um painel retrata uma única fatia confocal tirada de um z-stack. No painel B da mesma célula é descrita após deconvolução utilizando uma função de dispersão teórica ponto (PSF). Esta pilha de imagem borrada-se posteriormente usado para processar o celular e obter uma reconstrução volume 3D, como mostrado no painel de C ou uma reconstrução da superfície 3D (D). A barra representa 10 mM.

<ol>
	<li>Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, ., Licha, K., Lin, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Imaging II. Vol. 7370, 737008-737008 (2009).</li><li>Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+Drosophila+melanogaster+pupae+with+mesoscopic+fluorescence+tomography.">In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography.</a> Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).</li><li>Kaestner, L., Lipp, P., Shorte, S. L., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 289-289 (2007).</li><li>Kaestner, L., Lipp, P., Popp, J., von Bally, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optics in Life Science. Vol. 6633, 66330K-66330K (2007).</li><li>Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+delivery+of+short+hairpin+RNA+(shRNA)+mediates+efficient+gene+silencing+in+terminally+differentiated+cardiac+myocytes.">Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes.</a> Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).</li></ol>

O procedimento descrito para o isolamento de cardiomiócitos de rato pode ser adaptado para outras espécies, por exemplo, mouse 4, se necessário. Um parâmetro que as necessidades de adaptação é a mistura de enzimas para a digestão (veja abaixo) e também a duração da digestão. Estar ciente de que as células de algumas espécies (rato, por exemplo) pode ser mais frágil do que os outros (rato, por exemplo). A escolha da colagenase é provavelmente o passo mais importante...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Anesthesia solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 &mu;l Rompun (2% Xylazinhydrochlorid)</td>
</tr>
<tr>
<td>Citrate solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Solution A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Solution A+</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Liberase solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>F. Hoffmann&#x2010; La Roche Ltd.</td>
<td>11988476 001</td>
<td>500 &mu;l stock solution in 15 ml solution A (stock solution:
10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.)</td>
</tr>
<tr>
<td>Solution B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Content of solution A plus 200 &mu;M CaCl2 and 0.1% DNase solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Solution B1/2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1:1 mixture of solution A and solution B</td>
</tr>
<tr>
<td>DNase solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma&#x2010; Aldrich Co.</td>
<td>D4527</td>
<td>Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris&#x2010;HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithioerythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol</td>
</tr>
<tr>
<td>Extracellular matrix protein (ECM) solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Extracellular matrix protein (ECM) solution</td>
<td>E1270</td>
<td>1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mL
medium M199</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture medium M199</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PAA</td>
<td>E15&#x2010;834</td>
<td>Medium M199 supplemented with 1 &mu;l/ml ITS solution and 20 &mu;l/ml penicillin&#x2010;streptomycin solution (5000 units/ml)</td>
</tr>
<tr>
<td>ITS solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 &#x03BC;l Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clear
solution. Aliquots can be frozen.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tyrode</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Master mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5 &mu;l 10&#215;PCR&#x2010;Buffer, 5 &mu;l MgCl2 (25 mM), 2 &mu;l forward primer, 2 &mu;l reverse primer, 1 &mu;l dNTP&#180;s (10 mM each), 33 &mu;l H2O, 1 &mu;l DMSO, 1 &mu;l Taq&#x2010;DNA polymerase for each sample</td>
</tr>
<tr>
<td>LB&#x2010;Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Pac I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>R0547L</td>
<td>preparation: 50 &mu;g DNA, 5 &mu;l 10&#215;buffer, 0.5 &mu;l 100&#215;BSA,
0.75 &mu;l Pac I, fill with H2O up to final volume of 50&mu;l</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging

Miócitos cardíacos isolados de corações adultos são amplamente aceitos como um modelo em algum lugar a meio caminho entre as células musculares embrionárias e neonatal de um lado e um coração trabalho, por outro. Assim, cardiomiócitos servir como bons modelos para a fisiologia celular cardíaca e fisiopatologia, para as investigações farmacêuticos, bem como para a exploração de modelos animais transgênicos. Aqui nós descrevemos um método de isolar as células do coração. Além disso, mostramos como uma manipulação genética em miócitos cardíacos pode ser realizada sem criação de um animal transgênico: Esta é a combinação da cultura a longo prazo (uma semana) e transferência de genes adenovirais. O último é descrito a partir da construção do vírus para a transdução das células. Ele pode ser usado para a expressão de biossensores geneticamente codificado (GEBS), proteínas de fusão fluorescentes, mas também para a proteína mais expressão e regulação, por exemplo, usando RNAi. Aqui nós fornecemos um exemplo para a expressão de uma proteína de fusão coloração de uma estrutura subcelular (Golgi). Expressão da proteína como pode ser visualizado por imagem confocal de z-pilhas para uma reconstrução 3D de estruturas celulares. O protocolo compreende o estado-da-arte em cultura de células, biologia molecular e biofísica e, portanto, oferece uma abordagem para explorar novos horizontes em cardiologia celular.

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Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Adulto miócitos cardíacos são células primárias que podem ser isoladas de corações de animais e cultivados por vários dias. Dentro deste período a cultura de transferência de gene adenoviral podem ser usadas para expressar biossensores geneticamente codificado (GEBS) ou proteínas de fusão fluorescente. Ambas as abordagens permitem investigações celular por meio de microscopia confocal.

Isolamento e manipulação genética de adultos miócitos cardíacos for Imaging Confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

isolation-genetic-manipulation-adult-cardiac-myocytes-for-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K visualizações.  Universty of Saarland. Adulto miócitos cardíacos são células primárias que podem ser isoladas de corações de animais e cultivados por vários dias. Dentro deste período a cultura de transferência de gene adenoviral podem ser usadas para expressar biossensores geneticamente codificado (GEBS) ou proteínas de fusão fluorescente. Ambas as abordagens permitem investigações celular por meio de microscopia confocal.

Vídeo: Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Cultura primária de Miócitos Coração Adulto Rat

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Biologia

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissecção do giro denteado do hipocampo de rato adulto

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

Isolamento de miócitos atriais humanos para Medições Simultâneas de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitórios e correntes de membrana

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

Imagens de células Lesão de Membrana e Processos Subcelulares envolvidas no reparo

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolamento e Cultura de rato adulto Cardiomyocytes de sinalização celular e<em&gt; In vitro</em&gt; A hipertrofia cardíaca

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Eletroporação, Isolamento e imagem das miofibras

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). These pacemaker APs reflect the coordinated activity of numerous membrane currents and intracellular calcium cycling. However the precise mechanisms that drive spontaneous pacemaker activity in SAMs remain elusive. Acutely isolated SAMs are an essential preparation for experiments to dissect the molecular basis of cardiac pacemaking. However, the indistinct anatomy, complex microdissection, and finicky enzymatic digestion conditions have prevented widespread use of acutely isolated SAMs. In addition, methods were not available until recently to permit longer-term culture of SAMs for protein expression studies. Here we provide a step-by-step protocol and video demonstration for the isolation of SAMs from adult mice. A method is also demonstrated for maintaining adult mouse SAMs in vitro and for expression of exogenous proteins via adenoviral infection. Acutely isolated and cultured SAMs prepared via these methods are suitable for a variety of electrophysiological and imaging studies.

Methods are demonstrated for the isolation of sinoatrial node myocytes (SAMs) from adult mice for patch clamp electrophysiology or imaging studies. Isolated cells can be used directly or can be maintained in culture to permit expression of proteins of interest, such as genetically encoded reporters.

Métodos para o isolamento, Cultura e caracterização funcional de SINOATRIAL Nó miócitos de ratos adultos

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas do coração de rato adulto

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Isolamento e Caracterização de Fibroblastos Cardíacos Adultos e Miofibroblastos

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

Isolamento simultâneo e cultura de miócitos atrial, miócitos ventriculares e não-miócitos de um coração de rato adulto

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

Isolamento e manipulação genética de adultos miócitos cardíacos for Imaging Confocal

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