A insuficiência cardíaca é a principal causa de morte para homens e mulheres no mundo. Novas evidências sugerem que a alteração no metabolismo cardíaco e sistêmico contribui para a patologia da insuficiência cardíaca. Identificar rapidamente quais metabólitos afetam o acoplamento excitação-contração ainda é um desafio.
A abordagem tradicional do miócito cardíaco isolante do rato adulto é um processo demorado e desafiador. O método inovador neste artigo torna um processo rigoroso mais eficiente e mais fácil de realizar. Além disso, usando sonda fluorescente, podemos realizar muitas avaliações fenotípicas de como os produtos químicos podem induzir toxicidade cardíaca ou disfunção ao nível celular.
Ao identificar quais moléculas alteram a função do miócito, novas terapêuticas podem ser identificadas para o tratamento da insuficiência cardíaca. Usando camundongos transgênicos, podemos sondar diferentes genes para determinar o que pode prevenir e contribuir para a insuficiência cardíaca. Essas informações serão essenciais no futuro cura da insuficiência cardíaca.
Demonstrando o procedimento estarão Matthew Klos e um estudante Shreyas Suresh. Para começar, descongele a solução de laminina de trabalho no gelo. Usando uma pipeta P1000, aspire 200 microliters de laminina e arraste suavemente a ponta da pipeta ao longo de uma borda do clipe de cobertura esterilizada para permitir que a ação capilar retire uma quantidade minúscula de laminina para facilitar o acessório de deslizamento de cobertura à placa de seis poços.
Em seguida, expulse a lapminina restante no centro da tampa em um movimento circular. Espalhe a gota de laminina pelo deslizamento de cobertura. Coloque as tampas em uma incubadora Celsius de 37 graus por pelo menos uma hora e até 24 horas antes do isolamento.
Para isolar miócitos de um coração preparado no khb-hb frio, coloque a amostra sob um microscópio estéreo. Para evitar embolia, prime a cânula aórtica submergindo-a na solução KHB-HB e usando uma seringa de 20 mililitros para forçar a solução. Certifique-se de que o coração está submerso e que a cânula esteja preparada antes da excisão cardíaca.
Com 5 fórceps, cannulate o coração. Confirme o posicionamento adequado da cânula visualizando a ponta da cânula aproximadamente um milímetro acima da inserção aórtica no ventrículo. Em seguida, inicie o fluxo de KHB-HB girando a torneira no Langendorf.
Conecte a cânula ao Langendorf para perfundir o coração por cinco minutos. Em seguida, gire a torneira para mudar a perfusão do reservatório KHB-HB para o reservatório tampão de digestão. Quando o tampão de digestão chegar ao coração, defina um temporizador.
Colete o perfusato em um beaker de 100 mililitros estéril. Reabastecer o reservatório tampão de digestão conforme necessário com o perfusado até que o tempo de digestão tenha expirado. Após a digestão, em um béquer de 100 mililitros estéreis, separe as câmaras do coração com fórceps e tesouras iris.
Coloque cada câmara em um poço separado de uma placa de seis poços. Despeje cinco mililitros de solução de colagenase em cada poço. Use imediatamente uma tesoura para picar o tecido cardíaco em pedaços de aproximadamente um metro cúbico.
Usando uma pipeta de transferência estéril, triturar suavemente o tecido cardíaco picado com tampão de digestão. Uma vez que os pedaços de tecido se tornem brancos e penas, coloque a placa sob um microscópio invertido para examinar as células. Se o número de células viáveis for superior a 80% proceder a esticar as células em um tubo cônico de 50 mililitros usando um coador de células de 100 mícrons.
Se o número de células viáveis for inferior a 80% verifique o tempo que levou para se cannular. Se o tempo de canulação for superior a cinco minutos, tente outro coração. Caso não, teste novas ranhuras de colagenase através do programa de amostragem de colagenase.
Em seguida, pelota as células por centrifugação a 215 vezes g por dois minutos. A pelota deve ser compacta e não solta. Se a pelota estiver solta, a preparação contém muitas células mortas.
Em uma capa de cultura de tecido, resuspense a pelota compacta em 10 mililitros de tampão de parada. Pelotar as células novamente por centrifugação a 215 vezes g por dois minutos. Resuspense as células em cinco mililitros de tampão de revestimento.
Realize uma contagem de células em um contador de cito e ajuste o volume de tampão de revestimento para alcançar uma concentração final de miócito de duas vezes 10 para as quatro células por mililitro. Agora remova as tampas revestidas de laminina da incubadora. Aspire a gota de laminina se estiver presente.
Placa 200 microliters de suspensão de miólito em cada deslizamento de cobertura. Coloque as tampas em uma incubadora Celsius de 37 graus com 21% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono por duas horas para permitir a fixação. Depois de duas horas, tire as tampas e aspire as células nãoectadas.
Adicione dois mililitros de mídia cultural e cultura na incubadora a 37 graus Celsius por até quatro dias. Primeiro, remova o componente A e o componente B do kit potencial da membrana. Em um tubo cônico de 15 mililitros, combine 50 microliters do componente B e cinco microliters do componente A para formar uma mistura de corante de tensão.
Vórtice para misturar. Adicione 10 mililitros de mídia de revestimento ao tubo cônico de 15 mililitros contendo a mistura de corante de tensão para formar a mistura de corante potencial da membrana. Novamente, vórtice para misturar.
Em seguida, remova uma placa de seis poços de miócitos da incubadora. Aspire a mídia. Adicione 800 microliters da mistura de corante potencial da membrana a cada poço.
Cubra a placa com papel alumínio e deixe a placa em temperatura ambiente por 15 minutos. Depois disso, aspire a mistura de mídia de corante de cada poço e adicione um mililitro da solução modificada de Tyrode para cada poço. Cubra com papel alumínio.
Ligue o equipamento na ordem de microscópio, lâmpada de arco, HyperSwitch, sistema de interface de fluorescência, fonte de alimentação MyoCam, estimulador de campo e computador. Certifique-se de que os conjuntos de filtros de emissão de excitação são apropriados para o corante de imagem. Por exemplo, fura-2 é animado em 340 nanômetros e 380 nanômetros de luz.
Emite 510 nanômetros de luz. Fluo-4 e o corante da membrana de tensão são animados a 485 nanômetros de luz e emitem a 520 nanômetros de luz. Prime o sistema de gravação ligando o vácuo, abrindo totalmente o grampo da mangueira, e mergulhando suavemente cada seringa de 60 mililitros com a solução de Tyrode no coletor.
Para gravações de cálcio, use a solução padrão de Tyrode. Para gravações de tensão, use a solução modificada de Tyrode. Ligue o aquecedor da linha.
Mantenha a temperatura para que o perfusado na câmara esteja em 36 mais ou menos um grau Celsius por pelo menos 15 minutos. Em seguida, abra o software de aquisição. Certifique-se de que os parâmetros estão definidos para o corante de imagem correto.
Desligue o estimulador. No escuro, retire a folha da placa de seis poços e coloque uma mancha na câmara de ritmo. Coloque a placa sob um microscópio e foque nos miócitos usando o objetivo de 10X.
Uma vez em foco, comece a andar de campo estimulando em um hertz e 0,2 volts. Aumente gradualmente a tensão até que se obtenha um ritmo de um para um. Em seguida, aumente a tensão até 1,5 vezes que o limite seja atingido.
Mude do objetivo 10X para o objetivo 40X. Concentre-se em uma célula que está seguindo um ritmo de um para um. Ajuste as tonalidades plásticas para que apenas uma célula esteja no campo de visão.
Usando o software, coloque a área de caixa de interesse em sarcomeres bem definidos. Inicie o software de aquisição para iniciar a luz de excitação. Usando os filtros de densidade neutra, ajuste a configuração de intensidade de acordo para obter uma relação sinal-ruído adequada.
Aqui, são mostrados os traços representativos de encurtamento de cálcio e sarcomere registrados a partir de miócitos de camundongos C57BL/6 usando fura-2. Uma quantificação dos dados médios do conjunto obtidos de camundongos C57BL/6 e seus companheiros de lixo transgênicos não mostra diferença entre os grupos, exceto o tempo de relaxamento em 10 hertz pacing. O traçado de tensão gravado a partir de um miócito de rato C57BL/6 a 10 hertz foi processado para obter um sinal utilizável.
O conjunto teve um potencial de ação médio após um low pass Butterworth ou um filtro digital Savitzky-Golay mostrar diferenças sutis na forma dos potenciais de ação. Os traços registrados de miócitos de rato em um hertz mostram, além do sinal de tensão ser menor que o sinal de cálcio, a cinética de contração também é diferente. Isso ocorre porque os corantes de cálcio tampão de cálcio enquanto os corantes de tensão não.
Assim como os transitórios de cálcio, os miócitos demonstraram mudanças dependentes do ritmo em sua duração potencial de ação óptica. A prorrogação induzida por drogas do potencial de ação também foi demonstrada. Os últimos 11 segundos de uma gravação de 20 segundos indicaram que a exposição prolongada de miócitos à luz azul leva à atividade desencadeada.
Ao tentar este procedimento, a coisa mais importante a se lembrar é usar a luz de menor intensidade possível para que você não danifique os miócitos. Myocyte isolado usando nossa abordagem também pode ser usado para imunohistoquímica ou conduzido para análise de manchas ocidentais. A beleza desta técnica, permite que os pesquisadores avaliem rapidamente como a variedade de moléculas e genes ajudam o acoplamento excitação-contração usando um único sistema.
