Somos gratos ao Prof emérito Jean-Claude Perriard e Evelyn Perriard (Instituto Federal Suíço de Tecnologia, Suíça) para a introdução de técnicas de isolamento para rato neonatal e cardiomiócitos de rato. Gostaríamos de agradecer ao Prof Ju Chen e Prof Sylvia Evans (UCSD, EUA) para o seu apoio. Trabalho no laboratório de EE foi financiado por um MRC Carreira Estabelecimento Grant. SL é apoiado por uma K99/R00 caminho para a independência do prêmio NIH / NHLBI (HL107744). TMM foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da American Heart Association (11POST7310066).

O seguinte procedimento descreve um protocolo de 16,17 de dois dias para o isolamento e cultura de cardiomiócitos neonatais de rato. Todas as soluções são estéreis ou esterilizadas por filtração. Todas as ferramentas são esterilizados por esterilização da superfície com etanol a 75%. Exceto para a extração do tecido inicial, todas as etapas são realizadas em uma cultura de células de fluxo laminar capô estéril. Este protocolo destina-se ao isolamento de corações neonatais de rato 1-2 ninhada (s) - de aproximadamente 5-14 filhotes, mas pode ser adaptado para os tamanhos maiores de areia e de rato cardiomiócitos neonatais. Uso de mídia Escala / enzima, conforme apropriado. Para o trabalho com roedores neonatais, consulte as diretrizes da universidade local e regras estabelecidas pelo legislador e / ou programas de cuidados de animais e aderir ao seu protocolo de animais aprovado institucionalmente. Todos os métodos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Animal Care e Use Comitê de UC San Diego Institucional (IACUC), e aderir a federegulamentos ral e estadual. Dia 1. 1. Isolamento de tecido cardíaco de ratos Neonatal <ol><li> Preparar 50 ml de 1x PBS (sem Ca 2 +, Mg 2 +) suplementado com 20 mM de BDM 6-8, e dispersar em dois pratos de bactérias estéreis colocados em gelo. </li><li> Preparar 10 ml de meio de isolamento, em 50 mL de tubos Falcon cónicos estéreis. Mantenha todas as soluções no gelo. Esterilizar tesoura (uma curva, uma reta) e fórceps (curvas, Dumont No.7). </li><li> Ratinhos neonatais de 1-3 dias de idade são lavados rapidamente em solução de etanol a 75% para a esterilização da superfície. Os filhotes de cachorro são decapitados com uma tesoura estéril (em linha reta), eo peito é aberto ao longo do esterno para permitir o acesso à cavidade torácica eo coração (Figura 1A, Suplementar filme S1). Comentário Técnico: ratos neonatais com mais de 3 dias ser utilizado, mas resulta em menor número de células viáveis ​​2. </li><li> Os corações são extraídoso corpo com uma tesoura curva e transferidos imediatamente para o prato bacteriana contendo 1x PBS (sem Ca 2 +, Mg 2 +) com BDM 20 mM, em gelo. Todos os seguintes passos são realizados no capuz de cultura de células estéril. </li><li> Remover o tecido pulmonar, embarcações maiores (e átrios, se desejar). Corações na solução de lavagem de PBS 1x (sem Ca 2 +, Mg 2 +) com BDM 20 mM (em gelo) para remover o sangue. Transferência lavada corações de primeiro prato para o segundo prato bacteriana contendo 1x PBS (sem Ca 2 +, Mg 2 +) com BDM 20 mM (em gelo), com a pinça ou uma colher perfurada (Figura 1B). </li><li> Transferência limpo corações / lavado em uma gota de meio de isolamento (cerca de 250 mL; Figura 1C) em um terceiro prato bacteriana (no gelo) e use a tesoura curva para picar corações em pedaços pequenos (aproximadamente 0,5-1 mm 3, ou menores; Figura 1D, 1E). </li><li> Transferir corações picados num cónicatubo contendo 10 ml de meio de isolamento (em gelo), e incuba-se com agitação suave a 4 ° C durante a noite. </li></ol> Dia 2. 2. Tissue digestão enzimática e chapeamento de Células <ol><li> Pesa-se 15 mg de mistura de colagenase / dispase (Roche), e dissolve-se a mistura de enzima em 10 ml de meio L15-5 complementado com BDM (meio de digestão) 20 mM. Filtro esterilizado o meio de digestão na capa de cultura de células para um novo tubo de 50 ml estéril Falcon. </li><li> Preparar 30 ml de meio L-15 suplementado com BDM 20 mM, e meio de plaqueamento. </li><li> Placas de cultura de células casaco com solução de colagénio (Sigma C-8919) para um mínimo de 1 hora. Remover solução de colágeno (pode ser reutilizada) e de colágeno revestido pratos de cultura de células secas em fluxo laminar estéril de cultura celular capô. </li><li> Remover o tubo cónico contendo os corações pré-digeridas a partir de 4 ° C. Os fragmentos devem ser agregados (Figura 1G). Deixe os fragmentos de tecido para afundaro fundo do tubo e remover o sobrenadante (a certeza de não perder quaisquer fragmentos de tecido;. normalmente, cerca de 1 ml do meio de isolamento pode permanecer no tubo). Adicionar 5 ml de meio de digestão e 5 mL de L-15 suplementado com 20 mM de BDM para fragmentos de tecido e a suspensão oxigenado usando oxigénio ou ar, durante 1 minuto. </li><li> Transferir o tubo cónico selado contendo os fragmentos de tecido cardíaco em meio de digestão a 37 ° C num banho de água durante cerca de 2 minutos para ajustar a temperatura da solução de digestão. </li><li> Incubar fragmentos de tecidos cardíacos, a 37 ° C com agitação suave durante 20-30 minutos (por exemplo, agitador a 37 ° C, definida como não mais do que 60 rpm). Tempos de digestão pode depender muito mistura de enzimas e número de lote Cuidado:. Períodos de incubação mais longos ou concentrações mais elevadas de enzimas pode reduzir a viabilidade celular. </li></ol> Comentário técnico: Recomendamos o uso de uma mistura de colagenase / dispase de Roche (Ref. ª: 10269638001), que tem muito pouca variabilidade de lote para lote. A enzima clássico para o isolamento de cardiomiócitos de rato é tripsina e / ou colagenase tipo II 3,16-20 disponível a partir de Worthington (Cat No CLS-2). No entanto, o desempenho da colagenase II podem diferir substancialmente de lote para lote. Worthington normalmente permite o teste de vários lotes de colagenase para otimizar os tempos de digestão enzimática e uso. Alternativamente, Worthington vende um kit de isolamento de cardiomiócitos com uma mistura de enzima de pré-testada incluído, que pode ser adaptado para o isolamento de cardiomiócitos de rato 17 (Cat No.: NCIS). <ol start="7"><li> Coloque célula-filtro estéril (40-100 mM malha de nylon) em frescos estéreis de 50 ml de tubo falcon cônico. Coador de células pré-molhado com 5 ml de L-15 suplementado com 20 mM de BDM. Tritura-se fragmentos do tecido gentilmente através de um pré-humedecido de 10 ml de cultura de células de pipeta para cerca de 10-20 vezes. Os fragmentos de tecido deve dispersar principalmente durante este passo, libertando as células em suspension (Figura 1H). </li><li> Vamos maiores fragmentos de tecido de sedimentos e sobrenadante transferência contendo células suspensas em tubo cônico fresco através de células-filtro (Figura 1I). </li><li> Re-suspender os fragmentos de tecido não digeridas em 5 ml de meio de digestão e incubar durante um adicional de 5-10 minutos a 37 ° C com agitação suave. </li><li> Depois de continuar a digestão dos fragmentos de tecido restantes, gentilmente triturar tecido por 10-20 vezes e adicionar tubo contendo células cônicas a partir do primeiro digerir através de filtro de células. Lavar células-filtro com 5 ml de L-15 suplementado com 20 mM de BDM para permitir a passagem de todas as células digeridos. </li><li> Centrifugado tubo cónico contendo cardiomiócitos em suspensão durante 5 minutos a 300 rpm (aprox. 50-100 xg). Retirar o sobrenadante (contendo principalmente fibroblastos e células endoteliais), e re-suspensão da pelota celular em 10 ml de meio de placagem. </li><li> Células da placa em 10 centímetros de células prato de cultura (Figura 2A) e incubar durante 1H -3 em cultura de células incubadora. Este passo de pré-plaqueamento remove os fibroblastos e as células endoteliais (Figura 2B), que irá aderir ao prato de cultura de células não revestido (Figura 2C). </li><li> Após incubação, lavam cardiomiócitos não aderentes de 10 centímetros prato de cultura (re-suspender as células pipetando repetidamente o meio de plaqueamento em cima do prato), e as células ressuspensas transferência para um tubo Falcon de centrífuga estéril cónica (15 ml ou 50 ml). Opcional: Repita o passo de pré-chapeamento para remover fibroblastos adicionais a partir de células-suspensão. Se desejado, as células de fibroblastos e endoteliais aderentes podem ser ainda cultivadas. </li><li> Contagem de células (por exemplo, usando Neubauer hemocitômetro, tripan exclusão do azul de coloração 21). </li><li> Células da placa em colágeno revestido placas de cultura de células com uma densidade de cerca de 1,5 x 10 5 células por cm 2 (Figura 2D, ver também comenta na Tabela 1 na chapariae revestimento). Coloque os pratos em cultura de células incubadora e deixar em repouso por 12-18 horas para permitir a aderência e disseminação de cardiomiócitos. </li></ol> Dia 3 - Cultura de cardiomiócitos neonatais <ol><li> Prepare meio de manutenção e Pré-aquecer em 37 ° C banho-maria. Consulte a Tabela 1 para a adição de inibidores da proliferação ou agentes cronotrópicos, ou o processo para a transfecção lipossómica de cardiomiócitos neonatais de rato. </li><li> Um dia após o plaqueamento, cardiomiócitos deveria ter aderido à placa de cultura de células e de forma otimizada começar a se contrair espontaneamente (Figura 2E, 2F; Suplementar filme S2; consulte a Tabela 2 para problemas comuns durante o procedimento de isolamento / cultura). Substitua chapeamento meio com meio de manutenção, e da cultura por mais 1-5 dias. Mudança de meio, conforme necessário. </li></ol>

O uso de modelos animais para estudar doenças cardíacas se tornou padrão na pesquisa cardiovascular. Mais perto caracterização bioquímica desses modelos (ou seja, estudando as respostas diretas de células cardíacas a estímulos bioquímicos ou biomecânicos) normalmente requer o isolamento de tecidos cardíacos ou cardiomiócitos. Estudos que investigam as respostas fisiológicas do coração ex vivo (por exemplo, a acetilcolina 40, ou em cenários de isquemia-reperfusão 41)</s...

Os primeiros relatórios para a dissociação de sucesso e cultura de células cardíacas de roedores remonta à década de 1960 1,2. Mesmo então, Harary e Farley notado que os cardiomiócitos cultivados &quot;pode ​​fornecer um sistema único para o estudo dos requisitos da contractilidade periódica [, e podem] fornecem um meio para determinar a contribuição de diversas vias metabólicas para a [bater] processo&quot;. Embora Harary e Farley cardiomiócitos isolados e cultivados de ratos jovens, bem como o protocolo original foi adaptado e modificado por muitos cientistas ao longo dos anos, o procedimento de isolamento e cultura geral não mudou muito. No entanto, os melhores enzimas 3, soluções padronizadas de 4,5, e a adição do canal reversível e miosina ATPase BDM para proteger as células durante o procedimento de isolamento de 6-9 melhorou significativamente célula-produtividade e viabilidade. Adulto miocardiopatia vs neonatalcitos Cardiomiócitos isoladas e cultivadas a partir de murganhos ou ratos recém-nascidos têm várias vantagens sobre as culturas de cardiomiócitos adultos. Em primeiro lugar, o procedimento de isolamento para neonatais do rato ou do rato corações é mais fácil e menos dispendiosa, quando comparada com o isolamento de cardiomiócitos de rato ou um rato adulto 10. Cardiomiócitos neonatais são muito menos sensíveis a reintrodução de um meio contendo cálcio após dissociação, aumentando consideravelmente o rendimento celular. Outra grande vantagem é que os cardiomiócitos neonatais do mouse passar por uma desdiferenciação mais rápida - ciclo rediferenciaï que normalmente resulta em bater espontaneamente células 20 horas após o plaqueamento, enquanto cardiomiócitos adultos normalmente exigem estimulação para induzir contração. Cardiomiócitos neonatais também são mais facilmente transfectable com os métodos de transfecção lipossomal, enquanto cardiomiócitos adultos necessitam de vetores virais para a entrega bem sucedida de DNA transgênico. Em contraste com cardiomiócitos neonataiss, a cultura de cardiomiócitos de roedores adultos 11-13 permite investigações de degradação miofibrilar e eventual restabelecimento do aparelho contrátil. Estas alterações morfológicas características em cardiomiócitos adultos ocorrem em períodos de 1-2 semanas. A desdiferenciação - ciclo rediferenciaï é acompanhado por reexpressão do programa gene fetal, imitando assim alterações patológicas observadas em cardiomiopatias humanos 14. Outra vantagem de cardiomiócitos de rato adulto durante a cultura de cardiomiócitos neonatais é a capacidade de cultura destas células por longos períodos de tempo. Rato vs cardiomiócitos de rato O isolamento e cultura de cardiomiócitos de ratos recém-nascidos tem algumas vantagens sobre o de cardiomiócitos neonatais rato, incluindo rendimentos mais elevados de células viáveis ​​e aumento das taxas de transfecção. No entanto, a ampla utilização de modelos de ratos geneticamente modificados para doenças cardíacas (por exemplo, &lt;/ Em&gt; a lim muscular rato knockout proteína como modelo para cardiomiopatia dilatada 15) levou à adaptação do procedimento de isolamento de cardiomiócitos derivados de camundongos recém-nascidos. Embora os protocolos usados ​​para isolar neonatais cardiomiócitos de ratos e camundongos são quase idênticas, maior cuidado deve ser tomado na seleção de uma mistura de enzimas apropriadas para o último. Com efeito, os cardiomiócitos neonatais de rato são geralmente mais susceptíveis a overdigestion, resultando numa redução de rendimento celular e viabilidade. Além disso, a densidade do revestimento deve ser ajustado, por cardiomiócitos derivados de ratinhos neonatais são um tanto menor em comparação com células derivadas a partir de corações de ratos recém-nascidos. Com muitos usos para a investigação de parâmetros morfológicos, eletrofisiológicos, bioquímicos, celulares e biológicos e biomecânicos, bem como para o processo de myofibrillogenesis, cardiomiócitos neonatais cultivadas tornaram-se um dos sistemas mais versáteis para o estudo dafunções das células cardíacas in vitro. O primeiro passo para um ensaio bem sucedido no entanto, depende de uma metodologia simples e de confiança para isolar cardiomiócitos neonatais de rato. Nosso protocolo tira a sua metodologia de muitas fontes e foi otimizada para a reprodutibilidade e robustez. Discutimos fatores que influenciam cardiomiócitos-rendimento e viabilidade, e fornecer uma variedade de opções para a otimização de condições de isolamento e de cultura.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0753</td>
			<td>prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 &deg;C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>can be substituted with collagenase type II from Worthington</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II3</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x trypsin solution (0.25%) with EDTA</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>e,g, cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Hank's balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-199</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-060-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-030-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-155</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-045-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-6645</td>
			<td>proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6126</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoproterenol hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-6501</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% collagen solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8919</td>
			<td>extracellular matrix for coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mg/ml collagen type 1 solution</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td>alternative to Sigma collagen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>22363548</td>
			<td>appropriate filter size:40 &mu;m-100 &mu;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter 0.2 &mu;m</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>09-719C</td>
			<td>for sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight scissors</td>
			<td>e.g. Fine Sciences Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved scissors</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91461-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 7 forceps</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perforated spoon</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td>optional, for transfer of heart tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>e.g. Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>live cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemocytometer</td>
			<td>e.g. Prosource Scientific</td>
			<td>3500</td>
			<td>alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>14-432-23</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>05-527-90</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringe</td>
			<td>e.g. BD Medical</td>
			<td>14-820-19</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml serological pipette</td>
			<td>e.g. Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>for standard culture of cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish, glass bottom</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>for live cell imaging with inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>172958</td>
			<td>for preplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escort III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3037</td>
			<td>for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td>substitute for Escort III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffers and media: 
			<ul>
				<li>Isolation medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				0.0125% trypsin 
				in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+)</li>
				<li>Digestion medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix 
				in L15 medium</li>
				<li>Plating medium 
				65% DMEM high glucose 
				19% M-199 
				10% horse serum 
				5% fetal calf serum 
				1% penicillin/streptomycin</li>
				<li>Maintenance medium 
				78% DMEM high glucose 
				17% M-199 
				4% horse serum 
				1% penicillin/streptomycin 
				optional: 
				1 &mu;M AraC 
				1 &mu;M isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine</li>
			</ul>
			The plating and maintenance medium can be stored at 4 &deg;C for up to 6 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes

Cardiomiócitos neonatais cultivadas têm sido muito utilizados para estudar myofibrillogenesis e funções miofibrilares. Cardiomiócitos cultivados permitir a fácil manipulação e investigação das vias bioquímicas, e seu efeito sobre as propriedades biomecânicas do batimento espontâneo cardiomiócitos. O protocolo de 2 dias a seguir descreve o isolamento e cultura de cardiomiócitos neonatais do mouse. Mostramos como dissecar facilmente corações de recém-nascidos, dissociar o tecido cardíaco e enriquecer cardiomiócitos a partir da população de células cardíacas. Discute-se o uso de diferentes misturas de enzimas para a célula-dissociação, e seus efeitos sobre células-viabilidade. Os cardiomiócitos isolado pode ser posteriormente utilizado para uma variedade de,, ensaios com células-biológica ou bioquímica biomecânico electrofisiológicos morfológicas. Nós otimizamos o protocolo para a robustez e reprodutibilidade, usando soluções só comercialmente disponíveis e enzima mistura que show variabilidade pouco de lote para lote. Nós também tratar de problemas comuns associados com o isolamento e cultura de cardiomiócitos, e oferecem uma variedade de opções para a otimização das condições de isolamento e de cultura.

Usando este protocolo, foram isoladas a partir de 8 corações um dia de idade ratos neonatal (Figuras 1A, 1B, Suplementar filme S1). Após a lavagem e picagem dos corações com a tesoura (Figuras 1C-1F), fragmentos de tecido foram pré-digeridas em meio de isolamento durante a noite a 4 ° C com agitação suave. Após a pré-digestão (Figura 1G), transferimos os fragmentos de tecidos em meio de digestão acabado de fazer, e incubou-se os fragmentos de tecido durante...

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Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Culturas rato cardiomiócitos primários são uma das ferramentas fundamentais para a investigação da organização e função miofibrilar. O protocolo a seguir descreve o isolamento e cultura de cardiomiócitos primários de corações neonatais do mouse. As culturas de cardiomiócitos resultantes podem ser subsequentemente utilizados para uma variedade de biomecânicas, ensaios bioquímicos e celulares biológica.

Isolamento e Cultura de Neonatais rato Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

isolation-and-culture-of-neonatal-mouse-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Biology

62.0K visualizações.  King’s College London.  Culturas rato cardiomiócitos primários são uma das ferramentas fundamentais para a investigação da organização e função miofibrilar. O protocolo a seguir descreve o isolamento e cultura de cardiomiócitos primários de corações neonatais do mouse. As culturas de cardiomiócitos resultantes podem ser subsequentemente utilizados para uma variedade de biomecânicas, ensaios bioquímicos e celulares biológica. 

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Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos Neonatal

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Biologia

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Isolamento e gravações de canais Kv em Murino cardiomiócitos atriais e ventriculares

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolamento e Cultura do mouse primárias células pancreáticas acinares

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Isolamento e Fisiológica Análise de rato Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolamento e Cultura de rato adulto Cardiomyocytes de sinalização celular e<em&gt; In vitro</em&gt; A hipertrofia cardíaca

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Isolamento de Neonatal extra-hepáticas cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolamento, cultura e Transdução de rato adulto Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...