Este trabalho foi financiado pelo National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL-36573. Agradecemos ao Sr. David Sowa para a edição deste manuscrito.

Toda a pesquisa em ratos foi feito de acordo com os procedimentos e diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde, e os protocolos foram aprovados pelo Comitê Institucional Animal Care e Use, da Universidade de Toledo, da Faculdade de Medicina e Ciências da Vida. 1. Perfusão de preparação do sistema <ol><li> No dia antes do isolamento, preencher todo o sistema de perfusão (incluindo reservatórios) com uma solução de detergente alcalina livre de resíduos rápido. Permitir que a solução para absorver no sistema por algumas horas ou durante a noite. </li><li> Na manhã seguinte, ajustar a temperatura termociclador a 37 ° C e deixar a solução para aquecer. Remover a solução de detergente e lave o sistema cuidadosamente com água destilada esterilizada. Não se esqueça de todos os ramos laterais. </li><li> Encha o sistema com tampão de perfusão através de uma bomba peristáltica constante e tirar qualquer bolha de ar para fora da câmara de aorta (bolha armadilha) com uma seringa montado na lateral para protegero coração de oclusão coronária. A taxa de fluxo da bomba peristáltica deve ser verificada rotineiramente. </li></ol> 2. Preparação de Amortecedores, Meios de Cultura, e pratos <ol><li> Perfusão Tampão: Fazer 500 ml de tampão de perfusão 1x antes de usar. Este tampão isento de cálcio contém NaCl 113 mM, KCl 4,7 mM, 0,6 mM, KH 2 PO 4, 0,6 mM de Na 2 HPO 4, 1,2 mM MgSO4, 10 mM de Na-HEPES, 12 mM de NaHCO 3, 10 mM KHCO 3, 0,032 mM, vermelho de fenol, 30 mM de taurina, BDM 10 mM, e glucose 5,5 mM. Ajustar o pH para 7,0 com HCl 2 M e filtrar através de um filtro de 0,2 mM, armazenar a 4 ° C. Nota: a) A solução de perfusão devem ser preparadas no mesmo dia em que é usado. Em alguns casos, é aceitável para conservar a solução em menos de 3 dias a 4 ° C. b) Este tampão tem uma concentração de potássio de alta até 15,3 mm, o que pode manter os cardiomiócitos quiescente, reduzir ATP consumo e aumentar a capacidade de Ca 2 +-tolerante. </li><li> Digestão Buffer (300 U / mL, 25-50 mL / coração): preparar imediatamente antes da perfusão. Pesar 15.000 U de atividade total de colagenase tipo II, dissolver em 50 ml de tampão de perfusão na capa cultura. Adicionar 25 ul de 100 mM CaCl 2 (solução de estoque, filtro esterilizado) para que a concentração final de cálcio 50 uM. Aquecer o tampão a 37 ° C, quando pronto para isolamento. Ao contrário de tripsina, colagenase funciona melhor na presença de 50-100 uM de Ca 2 +. </li><li> Parar Buffer (50 ml / coração): Operar em capa de cultura. Misturar 45 ml de tampão de perfusão com 5 ml de FBS estéril. <ol><li> Ca 2 + solução de I (12,5 uM de Ca 2 +): Adicionar 2,5 mL de 100 mM de CaCl 2 a 20 ml de tampão de paragem e misturar. </li><li> Ca 2 + solução II (100 uM de Ca 2 +): Adicionam-se 10 ul de 100 mM de CaCl2 a 10 ml de tampão de paragem e misturar. </li><li> Ca 2 + solução de III (400 ^ M de Ca 2 +): Adicionar 40 ul de 100 mM de CaCl2 a 10 ml de tampão de paragem e misturar. </li><li> Ca 2 + solução de IV (900 ^ M de Ca 2 +): Adicionar 90 ul de 100 mM de CaCl2 a 10 ml de tampão de paragem e misturar. </li></ol></li><li> Galvanização meio (50 ml / coração): Transferência 43 ml de MEM contendo 2 mM L-glutamina e 1,26 mM CaCl 2 em um tubo cônico de 50 ml estéril na capa de cultura e adicionar 5 ml de FBS, 1 ml da solução de BDM ( 500 mM, esterilizado por filtração), e 0,5 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml). Misture e equilibrar durante 2-3 horas antes do isolamento dos miócitos em 2% de CO 2, 37 ° C incubadora com as tampas soltas. Logo antes dos miócitos chapeamento, adicionar 0,5 mL de ATP 200 mM (pH 7,2, solução de estoque, filtro esterilizado) para o meio. </li><li> O meio de cultura (50 ml / coração): Transferência de 48 ml de MEM contendo 2 mM de L-glutamina e 1,26 mM de CaCl2 para um tubo cónico de 50 ml estéreis em capa de cultura e adicionar 1 ml de uma solução de estoque de BDM (500 mM, filter esterilizada), e 0,5 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml). Misture e equilibrar em 2% de CO 2, 37 ° C incubadora antes do isolamento dos miócitos. Antes de usar, adicionar 0,5 mL de 100 mg / ml de BSA (esterilizado por filtração) para o meio. Nota: O uso de 2% de CO 2 incubadora facilita a manutenção do meio de cultura de pH 6,9-7,0, o que ajuda a manter as myoctyes sua morfologia em forma de haste até 24 horas. </li><li> Laminin (1-2 mg / cm 2) pratos ou placas revestidas de transferência: 200 ul de 1 mg / ml de laminina rato natural para 20 ml de PBS esterilizado (w / o cálcio e magnésio) e misturar. Adicionar 1 ml de pratos de 35 mm, 2,5 ml para pratos de 60 mm, ou 5 ml para pratos de 100 mm, agite para cobrir uniformemente a superfície, e coloque em 2% de CO 2, 37 ° C incubadora até miócitos chapeamento. Nota: Se os pratos ou placas não são utilizados no dia revestido, que pode ser selado com Parafilm e armazenado a 4 ° C durante a noite (Revestimento lenta). Vedação é required para impedir evaporação ou contaminação. Placas revestidas podem ser mantidas a 4 ° C durante até 1 semana. </li></ol> 3. Remoção Rato Coração e Canulação <ol><li> Mergulhe as tesouras e pinças em etanol 70% por 30 minutos e deixe-os secar. </li><li> Pesar o mouse para a 0,1 grama mais próximo. Grave o seu peso corporal, tensão, sexo e data de nascimento. </li><li> Injectar 200 ul de heparina (100 IU / ratinho) ip 10 minutos antes da anestesia para impedir a coagulação do sangue nas artérias coronárias. Anestesiar o rato com 200 mg / kg de peso corporal de cetamina e 10 mg / kg de peso corporal de xilazina por injecção ip e esperar por 5-10 min, até que o rato deixa de responder a beliscões cauda / toe. </li><li> Fixe o rato na posição supina, fixando suavemente as patas dianteiras e patas traseiras para uma superfície de trabalho pinnable (ou seja, isopor) em uma bandeja de cirurgia animal ou banco mesa perto do sistema de perfusão. </li><li> Limpe o peito e abdômen com etanol 70%. Faça uma pele i linha médiancision a partir de meados do abdômen para o diafragma com uma tesoura cirúrgica. </li><li> Corte o diafragma com uma outra tesoura cirúrgica e mantenha o esterno com uma pinça serrilhadas curvas. Corte bilateralmente e retroflect caixa torácica para expor o coração. </li><li> Levante o coração um pouco com a pinça serrilhada e atraumáticas curvas finas e dissecar o coração para fora da cavidade torácica, o mais próximo possível para dorsal da parede do tórax. </li><li> Transferir o coração para uma placa de 100 mm, contendo tampão de perfusão a frio. Corte com cuidado fora os tecidos conjuntivos, como pulmões, timo e brônquios. </li><li> Identificar a aorta e seus ramos cranianos, que geralmente são escondidos por timo e gordura abdominal. Corte a aorta abaixo de sua primeira filial 13, segure a parede da aorta, levante o coração, e um pouco colocá-lo para a cânula aórtica cheio de líquido de perfusão (1,0 mm de diâmetro externo da cânula de aço inoxidável com ponta romba / plano e entalhes 1 e 2 mm acima a ponta, ou um G agulha de alimentação reutilizável 22) usando dois ultra-fina com ponta forceps. Nota: a) O fluido de perfusão deve ser gotejamento durante punção cardíaca para evitar que as bolhas de gás de entrar nas artérias coronárias; b) manter a ponta da cânula imediatamente acima da válvula da aorta. </li><li> Prender a aorta para a cânula e ligar a aorta para a cânula com seda 6-0 cirúrgico. Toda a punção deve levar menos de 120 segundos. </li></ol> 4. Coração de perfusão e Digestão <ol><li> Perfundir o coração com tampão de perfusão isenta de cálcio no caudal de 4 ml / min 4-5 min até que os efluentes se claro, em seguida, mudar para tampão de digestão contendo 50 mM de CaCl2 e perfuse para 3,5-20 min dependendo do mouse tensão, pressão de perfusão e atividade da colagenase. Se for o caso, aumentar a pressão para 70-80 mmHg aorta quando digerir. Quando necessário, perfusato enzima pode ser recirculado para a digestão. Tipicamente, o tampão U / ml de enzima 300 irá digerir um coração em 10-12 min a um caudal de 4 ml / min;Se aplicar pressão diastólica em 70 mmHg, 300 U / ml terá apenas 3,5-5,5 min, a um caudal de 4 ml / min. </li><li> Pare de digestão quando o coração se torna um pouco pálido e flácido. Deve ser esponjoso quando beliscou suavemente. </li></ol> 5. Células dissociação e reintrodução de cálcio <ol><li> Puxe a aorta da cânula com 70% fórceps encharcada de álcool e colocar o coração em uma estéril prato de 60 mm contendo 2,5 ml tampão de digestão. Mover para a capa de cultura de uso de suprimentos estéreis, permanecendo consciente de técnicas estéreis para esta e as etapas de acompanhamento. </li><li> Remover aorta, átrios e grandes vasos com tesouras cirúrgicas finas. Gentilmente provocar o ventrículo em 10-12 pedaços pequenos com duas pinças de ponta fina. </li><li> Pipeta suavemente os pedaços do coração e células cima e para baixo ~ 10x com uma pipeta de 10 ml e depois transferir para um tubo cônico de polipropileno de 15 ml. Lave o prato com a solução de 7,5 ml de cálcio I contendo 12,5 mM CaCl2 e transferênciaeste para dentro do tubo, resultando num volume final de 10 ml. </li><li> Pipeta suavemente a suspensão de células para cima e para baixo, usando uma pipeta de transferência de ponta fina para dispersar os grandes pedaços de tecido do coração. </li><li> Em seguida, centrifuga-se durante 3 min a 20 x g para separar as células não-miócitos pequenas tais como as células endoteliais e fibroblastos. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de miócitos em 10 ml de solução de cálcio I, com um suplemento de 100 ul de ATP 200 mM (pH 7,2, solução de estoque, filtro esterilizado). Deixe o tubo na capa para 3-5 min. </li><li> Transferência duplicar 10 mL alíquotas a um hemocitômetro para contar miócitos e volta em forma de bastonete. Calcule o número total de miócitos e calcular a percentagem de miócitos em forma de bastonete. </li><li> Centrifugar os miócitos durante 3 min a 20 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender as pastilhas em 10 mL de cálcio II solução contendo 100 mM de CaCl 2. Dispersar os miócitos com a transferência pipeta de ponta fina pipetandocima e para baixo. </li><li> Repetir o passo acima (5,8), utilizando uma solução de cálcio III (400 ^ M de CaCl2) e IV (900 uM de CaCl 2), respectivamente. </li><li> Para rato miócitos cultura primária, ressuspender o sedimento miócitos final em 5 ml de chapeamento médio. Contar o número total de miócitos e calcular a percentagem de miócitos em forma de bastonete. </li></ol> 6. Cultura celular <ol><li> Ajustar a concentração de miócitos em forma de bastonete de 25.000 em forma de bastonete miócitos / ml para um tubo de 50 ml. Pipeta suavemente os miócitos com uma pipeta de 10 ml para suspendê-las bem. Evite sedimentação celular na pipeta e tubo para garantir a densidade de células iguais para cada prato ou prato. </li><li> Após aspiração fora da solução de revestimento laminina, placa miócitos para os pratos ou placas. Deslize suavemente os pratos ou placas frente e para trás e de lado a lado em um padrão de cross-como três a quatro vezes na superfície do capô cultura. </li><li> Coloque os pratos ou placas de CO 2%2 incubadora a 37 ° C. Incubar durante 1-3 horas para permitir a ligação de miócitos, a uma taxa de cerca de 80%. </li><li> Depois de penhora, aspirar cuidadosamente fora do meio contendo miócitos solto e restos celulares. Adicionar cuidadosamente o meio de cultura para os lados dos pratos ou placas. Realize esta uma mudança meio por um. Retornar imediatamente os pratos ou placas para a incubadora. </li><li> Após a cultura D / O, os miócitos pode ser alterado para o mesmo meio, sem BDM antes dos estudos de sinalização de células de curto prazo. Mantenha o BDM na cultura de longo prazo para os ensaios hipertróficas ou apoptose. Nota: BDM (2,3-butanodiona monoxime) pode inibir a miosina-ATPase e prevenir a contração. A sua inibição da contração à base de miosina é prontamente reversível. É relatado que BDM pode ter alguns efeitos colaterais, tais como agir como uma fosfatase não específica, aumentando a liberação de cálcio do RS, e alteração da concentração de cálcio livre e prope elétrica celularrties, portanto, antes do tratamento, a BDM deve ser removido. Além disso, em alguns casos, uma miosina II Blebbistatin inibidor específico pode ser uma alternativa para inibir a contracção dos cardiomiócitos 8,9. No entanto, em nossos casos, BDM é melhor do que Blebbistatin por causa da qualidade e quantidade dos cardiomiócitos. </li></ol>

<ol>
	<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).</li><li>Gross, D. R., Gross, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. , 109-130 (2009).</li><li>Schl&#252;ter, K. D., Piper, H. M., Dheim, S., Mohr, F. 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W., Delmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+working+heart.">The working heart.</a> Practical Methods in Cardiovascular Research. , 173-189 (2005).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dynamic+instability+and+wavelength+in+arrhythmia+maintenance+as+revealed+by+panoramic+imaging+with+blebbistatin+vs.+2,3-butanedione+monoxime.">The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).</li><li>Liu, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+Na/K-ATPase+potentiates+Marinobufagenin-induced+cardiac+dysfunction+and+myocyte+apoptosis.">Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+roles+of+the+cardiac+Na+/Ca2+-exchanger+in+ouabain-induced+inotropy,+cell+signaling,+and+hypertrophy.">Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).</li><li>Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+PI3K-AKT+signaling+pathway+with+digitalis-induced+hypertrophy+of+cardiac+myocytes.">Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).</li><li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Transcriptional+Profiling+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> J. Vis. Exp. (58), (2011).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Para a melhor preparação, as etapas mais críticas são: 1) imediatamente ligar o coração do mouse para a cânula após a excisão; 2) perfusão do coração apropriada. Além disso, observe que a qualidade da água, temperatura de perfusão, pH de tampão, esterilização, pureza química, e limpo, tubos e câmaras não-contaminados também são fatores importantes. 18,2 mohms biologia molecular grau H2O é altamente recomendado para a preparação buffer. O pH da solução de estoque de 200 mM de ATP deve ser ajustado para ...

Os cardiomiócitos não proliferativa. Existem algumas linhas celulares de cardiomiócitos atriais, como HL-1 e AT-1 de células derivadas de tumores de ratinho atrial; no entanto, não há linhas de células de cardiomiócitos ventriculares adulto disponíveis para pesquisa. Culturas de células primárias de cardiomiócitos adultos rato fornecer um modelo poderoso para a pesquisa do coração nos níveis celulares e moleculares. Até à data, têm sido amplamente utilizados para bioquímicos, fisiológicos e farmacológicos de pesquisa 1. Além disso, o uso frequente de camundongos geneticamente modificados exigiu métodos eficazes de isolamento de cardiomiócitos. Cultura pura permite condições livres de interação com outros órgãos e da circulação sistêmica, como através de fatores endógenos neuro-hormonais e hormônios como 2,3. No entanto, isolamento de cardiomiócitos pode ser um desafio. O protocolo apresentamos aqui é baseada em nossas experiências com cardiomyocyt rato adultoes e o método descrito por O&#39;Connell et al 4,5. Especialmente em 2007 5, descreveram técnicas detalhadas de preparações de buffer para cultura de células e ensaio funcional. Desde miócitos rato são altamente suscetíveis a contratura em comparação com os cardiomiócitos de ratos, os tampões ou mídia usada para a perfusão, a digestão, Ca 2 + tolerância, chapeamento e cultura no protocolo do mouse são complementadas com um inibidor de acoplamento excitação-contração inespecífica, 2, 3-butanodiona monoxime (BDM) para inibir a contracção espontânea, por conseguinte, a viabilidade e produtividade de miócitos em forma de bastonete, melhorar significativamente. No protocolo introduzido aqui, os miócitos são separados num tampão de alto teor de potássio do coração isolado por perfusão de Langendorff modificado com colagenase tipo II. Colagenase II rompe de forma eficaz para baixo da matriz intercelular e as células libera. A solução de perfusão também mantém o metabolismo celular a um nível baixo 6. Em comum, além, o sistema de coração isolado de Harvard Apparatus usamos aqui é bem projetado para a temperatura precisa e controle de pressão constante 7. Esta abordagem proporciona preparações altamente reprodutíveis e populações uniformes de tipo de célula única, que pode ser utilizado na cultura de uma noite para a medição de proteínas de sinalização ou de cultura de 2-3 dias para ensaios hipertróficas cardíacas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="774">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:257px;">Isolated heart system for small rodent</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">IHSR-mouse 73-4019</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Aortic Cannula, OD 1.0 mm</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">73-2816</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Dumont #4 Forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11294-00</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight sharp serrated scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">14070-12</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11050-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Curved, serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11052-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight Mini Serrefines clamps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">18054-28</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">MEM</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:99px;">11575-032</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:131px;">Worthington</td>
			<td style="width:99px;">4176</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mucosal universal detergent</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">Z637181</td>
			<td>Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy

Os avanços tecnológicos tornaram ratos geneticamente modificados, incluindo transgênicos e camundongos knockout do gene, uma ferramenta essencial em muitos campos de pesquisa. Cardiomiócitos adultos são amplamente aceito como um bom modelo para a fisiologia celular cardíaca e fisiopatologia, bem como para a intervenção farmacêutica. Camundongos geneticamente modificados exclui a necessidade de processos de infecção de cardiomiócitos complicadas para gerar o genótipo desejado, que são ineficientes devido à diferenciação terminal &#39;cardiomiócitos. Isolamento e cultura de alta quantidade e qualidade cardiomiócitos funcionais irá beneficiar dramaticamente pesquisa cardiovascular e fornecer uma ferramenta importante para a sinalização celular pesquisa transdução e desenvolvimento de medicamentos. Aqui, descrevemos um método bem estabelecido para o isolamento de cardiomiócitos adultos do mouse que podem ser implementadas com pouco treinamento. O coração do mouse é retirado e canulada a um sistema de coração isolado, então perfundidos com um livre de cálcio e de alto potassium tampão seguido pelo tipo II digestão colagenase em Langendorff modo perfusão retrógrada. Este protocolo produz um resultado consistente para a recolha de cardiomiócitos de rato adulto funcionais a partir de uma variedade de ratinhos geneticamente modificados.

1. Quantificação de isolamento bem sucedido Dois critérios são utilizados para quantificar o sucesso do isolamento: em primeiro lugar, o número total de cardiomiócitos isolados, e em segundo lugar, a proporção de cálcio-tolerante para arredondar miócitos não tolerantes em forma de bastonete. Geralmente este protocolo leva em torno de 75-90 min de remoção coração para chapeamento de miócitos e os rendimentos em torno de 1 milhão de cardiomiócitos em forma de bastonete (70-90% d...

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Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Nós descrevemos um método confiável para isolamento de cardiomiócitos adultos do mouse. Este protocolo produz um resultado consistente para a cultura de cardiomiócitos adultos funcionais a partir de uma variedade de camundongos geneticamente modificados.

Isolamento e Cultura de rato adulto Cardiomyocytes de sinalização celular e<em&gt; In vitro</em&gt; A hipertrofia cardíaca

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

isolation-culture-adult-mouse-cardiomyocytes-for-cell-signaling-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

47.3K visualizações.  University of Toledo College of Medicine and Life Sciences.  Nós descrevemos um método confiável para isolamento de cardiomiócitos adultos do mouse. Este protocolo produz um resultado consistente para a cultura de cardiomiócitos adultos funcionais a partir de uma variedade de camundongos geneticamente modificados. 

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Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

Isolamento e manipulação genética de adultos miócitos cardíacos for Imaging Confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Biologia

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Profiling única célula transcricional dos cardiomiócitos de rato adulto

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolamento e Cultura de Neonatais rato Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Isolamento e Fisiológica Análise de rato Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolamento, cultura e Transdução de rato adulto Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolamento e Cultura de Queratinócitos de Rato Primário de Pele de Rato Neonatal e Adulto

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

Isolamento dos keratinócitos epidérmicos do camundongo e sua cultura Clonogênica in vitro

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...