A preparação de explantes de lente epiteliais foi adaptado a partir de métodos originado no laboratório do Dr. John McAvoy 9. Este trabalho é financiado pelo National Eye Institute, Programa de Pesquisa Intramural Z01-EY000238-22

Parte 1: Remoção de lentes Materiais e reagentes: <ol><li> Micro-tesouras de dissecação, curvado, dicas blunt, (tais as.RS-5983, Roboz Surgical Instrument Co., Inc, Gaithersburg, MD); micro-pinças de dissecação ponta, curvadas (como Roboz # RS5137). </li><li> Meio de suspensão: Meio 199 contendo 0,1% de albumina bovina sérica, 100 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 100μg/ml, 2,5 mg / ml anfotericina B. Os reagentes estão disponíveis a partir Invitrogen, Carlsbad, CA. </li></ol> Procedimento: <ol><li> Euthanize ratos recém-nascidos (com idade entre 2-4 dias), em conformidade com as orientações fornecidas pelo National Institutes of Health, Bethesda, MD. </li><li> Remove as pálpebras com uma tesoura cirúrgica. Pressione delicadamente com uma pinça curva em lados opostos da órbita ocular para forçar o olho a protuberância para fora. Fazer uma pequena incisão no lado posterior do olho com a tesoura. Pressionando com uma pinça contra a lateral do olho oposto a incisão, a lente e uma pequena quantidade de humor vítreo ligado pode então ser forçado para fora através da ruptura, permitindo que a lente a ser pego com uma pinça curva. Cuidados devem ser tomados para não quebrar a cápsula do cristalino. </li><li> Use a pinça curvas para as lentes de transferência para uma placa de cultura de tecido de plástico contendo 60 milímetros 5ml quente, meio de suspensão estéril. </li></ol> Parte 2: Microdissecção de explantes Materiais e reagentes: <ol><li> Micro Pinças de dissecação, 0,1 dicas mm, (como Roboz RS-4976). Usamos liga Dumostar devido à flexibilidade da ponta, mas outras ligas de aço também são aceitáveis. Pinça com pontas mais finas do que 0,1 milímetros não são recomendados, pois eles tendem a quebrar ou dobrar durante este procedimento. </li><li> Meio de suspensão (ver parte 1) </li><li> Não suplementado meio Ham F12 ou Médio 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA) </li></ol> Procedimento: <ol><li> Os seguintes passos devem ser realizados em um ambiente limpo, sem correntes de ar ambiente, utilizando ferramentas de dissecação e estéril meio estéril. </li><li> Usando um microscópio estéreo de dissecação, limpar as lentes de qualquer tecido conjuntivo aderente com a pinça de ponta 0,1 mm e transferi-los para um prato de cultura contendo 60 milímetros segundo meio de suspensão 5ml estéril (esta etapa ajuda a reduzir a contaminação). Com a pinça, transfira o número desejado de lentes para um prato de cultura contendo 35 milímetros 5ml médio, estéril não suplementado. (Muitas vezes usamos F12 Ham (Invitrogen) para esta etapa, pois a menor concentração de corante torna a dissecção mais fácil, no entanto, Meio 199 também é aceitável Sem antibióticos ou outras adições são necessários durante esta etapa..) Como muitos como 12 explantes podem ser feitas no centro de um prato desse tamanho. No entanto, um prato de 35 mm deve ser usado mesmo se explantes menos devem ser feitas, porque as ferramentas de dissecação não pode ser manipulado facilmente em um pequeno prato. Colocar a cápsula contendo as lentes restantes para uma cultura de tecidos incubadora a 37 ° C até serem necessárias. </li><li> Identificar a face posterior da lente. Há muitas maneiras de reconhecer isso: 1) O posterior é mais arredondada do que a anterior, que é um pouco achatado, 2) de ratos recém-nascidos lentes de catarata forma fria como eles arrefecer à temperatura ambiente durante a dissecção. Se a catarata frio não foi completamente cheio a lente, o lado posterior é o lado mais distante da região opaca. Se a opacidade encheu a lente, o aquecimento do prato para 37 ° C por alguns minutos vai revertê-lo. O lado posterior podem ser identificadas como as reformas de catarata com o resfriamento. 3) Vestígios da túnica vasculosa lentis pode ser visível no lado posterior. 4) A sutura posterior pode ser visível no lado posterior. Identificar o lado posterior corretamente é essencial, uma vez que este é o local onde a cápsula será aberta. Abertura da lente na face anterior vai rasgar o epitélio. </li><li> Uma vez que o lado posterior foi identificado, transformá-lo para cima e agarrar as lentes da pinça esquerda (para um trabalhador com a mão direita). Em seguida, aperte a cápsula posterior com a pinça direito de produzir uma pequena dobra. </li><li> Enquanto segura a cápsula posterior com a pinça direita, segure a dobra da cápsula com a pinça esquerda e puxe os dois pares de pinças em direções opostas para fazer um pequeno rasgo na cápsula. </li><li> Ao segurar a borda da cápsula retraindo com a pinça, puxe-o para baixo, primeiro de um lado, depois do outro, pressionando-o no plástico do prato com a pinça. Repita isso várias vezes, movendo-se em todo o equador da lente, até que a cápsula está firmemente ligado à placa em muitos pontos. Segurando a cápsula no lugar com a pinça esquerda, agite levemente a massa de fibra com a pinça direito de quebrar o vínculo entre as células de fibras e células epiteliais no equador do cristalino. Em seguida, empurre a massa de fibra de distância, rolando-o fora da cápsula / epitélio, que permanece preso à parte inferior doprato. Continue esse processo com todas as lentes no prato. Retire e deite fora as massas de fibras (ou salvá-los congelados como fonte de proteínas das lentes para outros estudos). </li></ol> Parte 3: Microdissecção e cultura de explantes centrais Materiais e reagentes: <ol><li> Estéril bisturi descartável, lâmina # 15, (Cincinnati Surgical Co. Cincinnati, OH) </li><li> Fosfato estéril salina tamponada com cálcio e magnésio (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Meio de cultura: meio de suspensão contendo 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO). </li></ol> Procedimento: <ol><li> Utilizando um escalpelo esterilizado, apare o epitélio periférico (PE), que contém células em estágios iniciais de diferenciação (Figura 1A), deixando uma praça central de aproximadamente 2,0 milímetros de um lado, composta por células epiteliais centrais apenas (CE) (Figura 1B). </li><li> Transferência do prato contendo os explantes central para uma cabine de segurança biológica. Lavar 3 vezes com PBS estéril, contendo cálcio e magnésio, e uma vez com 1ml de meio de suspensão fresco, equilibrado (37 CO ° C, 5% 2). Essas lavagens reduzir muito a probabilidade de contaminação. </li><li> Adicionar 2 ml de meio de cultura para induzir a diferenciação de uma, e coloque os explantes em umidificado, cultura de tecidos incubadora a 37 ° C CO, 5% 2. Períodos de cultura pode ser tão curto quanto algumas horas ou prolongar o tempo que duas a três semanas, dependendo do parâmetro que está sendo estudado. Médio deve ser trocada a cada 2-3 dias. </li></ol> Parte 4: A colheita de explantes para a análise de eventos associados com a diferenciação 1. Explantes colheita para análise de proteína ou RNA Materiais: <ol><li> Pinças Microdissecting </li><li> SDS Lysis Buffer de RNA ou mais tarde </li></ol> Procedimento: <ol><li> No final do período de incubação, remova o meio de cultura. </li><li> Usando o microscópio estéreo de dissecação, com cuidado, solte as bordas de cada explante. </li><li> Levantar cada explante com a pinça e transferir para um tubo contendo cerca de 100μl tampão de lise SDS (para análise de proteínas) ou RNA-posterior (para análise de RNA). Agitar a ponta da pinça na solução para garantir que o explante não ficar com a pinça. </li></ol> 2. Explantes de colheita, para imunofluorescência Materiais e reagentes: <ol><li> Tampão fosfato salino com cálcio e magnésio (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Tampão fosfato (sem cálcio e magnésio) (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Paraformaldeído 4% (Bioproducts Boston, Worcester, MA) </li><li> Pinças Microdissecting </li><li> Pena de marcação hidrofóbica </li><li> Microscópio de lâminas de vidro </li><li> 0,25% Triton X-100 em tampão fosfato salino. </li></ol> Procedimento: <ol><li> Enxaguar explantes brevemente em PBS contendo cálcio e magnésio. </li><li> Fixar tecidos, adicionando paraformaldeído a 4% por 30 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Remova o fixador e substituir com tampão fosfato salina. Explantes fixa-se um pouco rígida, permitindo-lhes ser levantado e transferido para lâminas de vidro para a imunocoloração. </li><li> Coloque uma pequena gota de PBS (sem cálcio e magnésio) no slide para ajudar a posicionar o tecido e evitar curling. Usando uma pinça microdissecting, levante o explante e insira-o a queda no slide. Sem tocar o explante, cuidadosamente remover o líquido com um pavio de papel para achatar o explante no vidro e deixar o tecido secar ao ar em temperatura ambiente por 3-5 minutos. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1519/fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 A. O epitélio periféricos expressa diferenciação proteínas específicas. O explante foi mostrado histoquímica para N-caderina imediatamente após microdissecção. Expressão é visto em uma faixa de células do epitélio periféricas, indicando que as células nesta região começaram a se diferenciar. B. O epitélio periférico pode ser aparado para remover as células que expressam N-caderina e outros diferenciação proteínas específicas. O anel vermelho representa a localização das células que expressam N-caderina, enquanto o pequeno quadrado delineado em cinza representa o quadrante do epitélio mostrado no painel de 1A. O epitélio periféricos podem ser removidos por quatro cortes de bisturi, deixando um quadrado central que contém apenas as células que ainda não começaram a se diferenciar.

<ol>
	<li>McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+(FGF)+induces+different+responses+in+lens+epithelial+cells+depending+on+its+concentration.">Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration.</a> Development. 107 (2), 221-228 (1989).</li><li>Campbell, M. T., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+fibre+differentiation+in+cultured+rat+lens+epithelium+under+the+influence+of+neural+retina-conditioned+medium.">Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium.</a> Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).</li><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+lens+epithelial+explants+induced+to+differentiate+into+fibres+by+fibroblast+growth+factor+(FGF).">Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF).</a> Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).</li><li>Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+major+intrinsic+protein+(MIP)/aquaporin+0+expression+in+rat+lens+epithelia+explants+requires+fibroblast+growth+factor-induced+ERK+and+JNK+signaling.">Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling.</a> J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).</li><li>Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+is+required+for+lateral+induction+of+Jagged1+during+FGF-induced+lens+fiber+differentiation.">Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation.</a> Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).</li><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-induced+lens+cell+proliferation+and+differentiation+is+dependent+on+MAPK+(ERK1/2)+signalling.">FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling.</a> Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).</li><li>Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cooperation+between+two+silencers+creates+an+enhancer+element+that+controls+both+the+lens-preferred+and+the+differentiation+stage-specific+expression+of+the+rat+beta+B2-crystallin+gene.">The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene.</a> Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).</li><li>Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alphaA-crystallin+via+Pax6,+c-Maf,+CREB+and+a+broad+domain+of+lens-specific+chromatin.">Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin.</a> The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).</li><li>McAvoy, J. W., T, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+retinas+promote+cell+division+and+fibre+differentiation+in+lens+epithelial+explants.">Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants.</a> Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).</li></ol>

O rato sistema explante lente tem sido utilizado com sucesso por um número de laboratórios para estudar a diferenciação terminal das células epiteliais lente para lente de fibras 21,3,4,5. Quando exposto a FGF-2 em 100ng/ml explantes começará a mostrar mudanças na sinalização em poucos minutos 6, com as mudanças na morfologia e expressão de genes que aparecem sequencialmente durante vários dias 3,4,5. As culturas permanecem viáveis ​​por 2-3 semanas, se o cuidado é tomado para evitar contaminação. Os explantes centrais descritas neste protocolo são especialmente úteis para estudar a seqüência de eventos associados com a diferenciação, uma vez que contêm poucas ou nenhumas células que expressam marcadores de diferenciação antes de FGF-2 é adicionado 1,5. As células então diferenciar de forma síncrona, como um grupo, tornando possível acompanhar a evolução no tempo da sinalização e eventos transcricionais associadas com a diferenciação. Explantes de cultura para diferentes comprimentos de tempo, portanto, fornece informações precisas sobre os temporais eventos seqüência. Inibidores específicos podem ser adicionados ao meio de cultura para identificar relevantes vias de sinalização. Explantes podem ser usados ​​para analisar a expressão de proteínas por eletroforese em gel de SDS e immunoblotting ou para analisar a expressão de mRNAs específicos por RT-PCR. Faixa de rendimento de proteína 20-50 mcg / explante e rendimento de RNA é de cerca de 200-600 ng / explante, dependendo da duração do período de cultura. Nós geralmente descobrimos que explantes por 5-6 prato irá fornecer proteínas suficientes ou RNA para ensaios diversos. RNA a partir de explantes também pode ser usado para preparar cDNA para avaliar a expressão gênica por microarranjos de análise, que pode identificar novos genes que podem ser fundamentais para diferenciação. Explantes também podem ser transfectadas. Apesar de a eficiência de transfecção é geralmente baixa, é suficiente para assaying genes repórter 4, 7, 8. Microscopia de imunofluorescência dos explantes oferece um complemento útil para métodos bioquímicos determinando a localização subcelular de proteínas de interesse. Assim, a preparação ea cultura de explantes de lente rato fornece um sistema poderoso para estudar a diferenciação terminal lente em mamíferos, que podem complementar em técnicas in vivo, tais como a geração de camundongos transgênicos e knock-out.

preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation

A superfície anterior da lente ocular é coberto por uma monocamada de células epiteliais, que proliferam em uma zona anular subjacente ao corpo ciliar. Após a divisão, essas células migram posteriormente, onde FGF difusão da retina os induz a se diferenciar em uma vasta posterior de células lente alongado fibra, que compõem o grosso da lente. Diferenciação das células epiteliais em fibras lente lente pode ser induzida in vitro pelo cultivo de explantes da região central do epitélio anterior, na presença de FGF-2. Explantes são preparados a partir de lentes de ratos recém-nascidos através da remoção da lente do olho e agarrar a cápsula da lente no lado posterior com uma pinça de dissecação. A cápsula posterior é então delicadamente rasgada e pressionado para o fundo de plástico de um prato de cultura de tecidos. As regiões periféricas do explante são removidos com um bisturi ea área central é, então, cultivadas na presença de 100ng/ml FGF-2, enquanto 2-3 semanas, dependendo dos parâmetros a serem estudados. Como as células epiteliais em explantes cultivados diferenciar em sincronia aproximada por um período de dias ou semanas, o tempo de sinalização e expressão gênica pode ser determinada usando técnicas moleculares, bioquímicos e farmacológicos. Microscopia de imunofluorescência é um complemento poderoso para estes métodos, uma vez que demonstra a localização subcelular de proteínas de interesse e pode revelar as conseqüências fisiológicas de manipulações experimentais de vias de sinalização.

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Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

Explantes da região central da lente de ratos epitélio diferenciar de forma síncrona quando cultivadas na presença de FGF-2. Microscopia de imunofluorescência de tais culturas pode fornece informações romance sobre a expressão gênica e eventos de sinalização associado com a diferenciação terminal.

Preparação e Cultura de explantes Rat Lens epitelial para estudar a diferenciação terminal

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

12.6K visualizações.  National Eye Institute (NEI), National Institutes of Health (NIH). Explantes da região central da lente de ratos epitélio diferenciar de forma síncrona quando cultivadas na presença de FGF-2. Microscopia de imunofluorescência de tais culturas pode fornece informações romance sobre a expressão gênica e eventos de sinalização associado com a diferenciação terminal.

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Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Cultura Slice organotípicas de E18 cérebros de ratos

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Biologia

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed protocol for biolistic transfection of rat hippocampal slices, from the initial preparation of DNA coated bullets to the final shooting of the organotypic slice cultures using a gene gun. Gene gun transfection is an efficient and easy means of transfecting neurons and is especially useful for fluorescently labeling a small subset of cells in tissue slice. In this video, we first outline the steps required to coat gold particles with DNA. We next demonstrate how to line the inside of plastic tubing with the gold/DNA bullets, and how to cut this tubing to obtain the plastic cartridges for loading into the gene gun. Finally, we perform biolistic transfection of rat hippocampal slice cultures, demonstrating handling of the Bio-Rad Helios gene gun, and offering trouble shooting advice to obtain healthy and optimally transfected tissue slices.  

We describe a method for preparing DNA coated gold bullets and demonstrate the use of such bullets to biolistically transfect neurons in cultured hippocampal slices.

Preparação de Gene Gun Bullets e Transfection biobalística de neurônios em cultura Slice

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

Primárias células epiteliais brônquicas humanas Grown a partir de explantes

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

Preparação de tendões da cauda de rato de Estudos biomecânicos e Mechanobiological

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Um sistema para a cultura de células epiteliais pigmentadas da íris para estudo da regeneração Lens em Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

Um novo método para a Cultura e polarizada Estimulação dos Humanos explantes mucosa intestinal

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Preparação de Rat Serum Indicado para cultura de embriões de mamíferos Whole

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

Lente livre de microscopia para a dinâmica e a análise quantitativa de cultura de células aderentes

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

Isolamento, purificação e diferenciação de precursores de osteoclast da medula óssea de ratos

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Isolamento e enriquecimento de células progenitoras epiteliais pulmonares humanas para a cultura organoide

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...