Este trabalho de pesquisa recebeu apoio financeiro da União Europeia (transMed; H2020-MSCA-765441), o conselho de pesquisa alemão (DFG; PA1751/8-1, 10-1) e o conselho de bolsas da China.

Os protocolos animais em conformidade com o §4º da lei alemã de proteção animal foram revisados e aprovados pelo Comitê de Proteção Animal da Universidade de Tübingen (Einrichtung für Tierschutz, Tierärztlichen Dienst und Labortierkunde; Registro Nº. AK02/19M). Neste estudo, as retinas foram obtidas a partir de camundongos do tipo selvagem (WT) e rd1, sendo este último um modelo bem caracterizado para degeneração da retina hereditária15. Os camundongos estavam alojados sob iluminação cíclica branca padrão, tinham livre acesso a alimentos e água, e eram usados independentemente do sexo.
1. Lista de verificação
<ol><li>Para garantir condições estéreis e evitar contaminações, limpe e desinfete a capa de fluxo de ar laminar com 70% de etanol. Certifique-se de deixar o etanol evaporar completamente, para evitar a intoxicação das culturas da retina.</li>
	<li>Ferramentas de autoclave (por exemplo, tesoura, fórceps e colher de raspagem de microscópio oftálmico) antes de usar.</li>
	<li>Prepare as seguintes mídias com antecedência sob uma coifa de fluxo laminar, sob condições estéreis: meio Basal R16 (BM) (pode ser armazenado a 4 °C por 4 semanas), BM com soro de bezerro fetal de 20% (FCS) (uso do mesmo dia), BM com 4 °C 0,12% proteinase K (44 mAnson U/mg) solução (uso do mesmo dia) e meio R16 completo com suplementos (CM) como descrito por Romijn16 (pode ser armazenado a 4 °C por 3 semanas) (ver Tabelas S1, S2 e S3).</li>
	<li>Pré-aqueça a solução proteinase K a 37 °C para ativá-la e usá-la na etapa 2.5.</li>
</ol>2. Preparação
<ol><li>Sacrifício do animal rd1/WT no dia pós-natal (P) 5 por decapitação. Para animais com idade inferior a P11, utilize CO2 e/ou luxação cervical, de acordo com as normas locais de proteção animal.</li>
	<li>Dependendo da idade do animal, antes da enucleação, se necessário, abra as pálpebras dos olhos usando fórceps e separe cuidadosamente as pálpebras, sem tocar ou coçar o olho abaixo.</li>
	<li>Enuclear rapidamente os olhos sob um estereóscópio usando fórceps curvas.</li>
	<li>Incubar os olhos em BM por 5 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Incubar os olhos em BM pré-aquecido, com 0,12% de proteinase K a 37 °C por 15 min.</li>
	<li>Realize as seguintes etapas dentro de uma coifa de fluxo de ar laminar para garantir condições estéreis. Para inativar proteinase K, transfira os olhos para BM contendo 20% de FCS e incubar por 5 min na RT.</li>
	<li>Disseca os olhos sob um estereóscópio, asepticamente, em uma placa de Petri contendo BM fresco na RT. Inicie a dissecção o mais rápido possível após a enucleação. Quanto mais tempo este tempo é, mais difícil é dissecar a retina, os olhos ficando muito macios.<ol>
<li>Com fórceps, segure o olho do nervo óptico. Usando uma tesoura fina, faça uma pequena incisão na córnea criando 2 bordas de onde a córnea, o coroide e a esclera podem ser delicadamente descascados usando 2 pares de fórceps finos(Figura 1 passos A-C). Alternativamente, use uma cânula de bitola estreita para fazer uma primeira incisão na córnea e, em seguida, inserir uma das lâminas da tesoura na abertura.</li>
		<li>Segure a lente com fórceps finos. Coloque um segundo par de fórceps perpendicularmente para os primeiros para que os primeiros fórceps estejam entre as 2 hastes do segundo. Puxe para extrair a lente do copo dos olhos. Se o vítreo e o corpo ciliar ainda estiverem presos à retina, remova-os cuidadosamente(Figura 1 passo D). NOTA: As etapas 2.7.1 e 2.7.2 precisam de prática e garantir cautela para não danificar a retina.</li>
		<li>Corte a retina perpendicular às suas bordas em quatro pontos, criando uma forma de trevo de quatro folhas(Figura 1 passos E-F).</li>
		<li>Usando uma pipeta com base amplamente cortada de uma ponta de 1 mL, segure a retina em uma gota de meio e transfira-a para uma inserção de filtro de prato de cultura colocada em uma placa de cultura de 6 poços. A camada RPE deve enfrentar a membrana (Figura 1 passo G).</li>
		<li>Com uma pipeta, remova cuidadosamente o excesso de meio da inserção.</li>
		<li>Dos lados do poço, adicione 1 mL de CM por poço e incuba em uma incubadora estéril a 37 °C com 5% de CO2. Não submergir a retina no meio, pois isso reduzirá a oxigenação e causará degeneração tecidual. A explanta deve permanecer na interface entre líquido e ar, coberta apenas por uma fina película de líquido criada pela tensão superficial da água.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deixe a explantização da retina intacta durante as primeiras 48 horas para facilitar a recuperação após o procedimento de explantação.</li>
	<li>Mude o meio a cada dois dias (48 h). Descarte 700 μL de meio de cada poço e adicione 900 μL de CM fresco ao poço. Dessa forma, a quantidade de médio perdido pela evaporação é recuperada e a explanta da retina mantém alguns dos fatores neuroprotetores produzidos nas 48 h anteriores.</li>
	<li>Incubar o meio removido em um tubo de microcentrifuge separado e fechado, juntamente com as culturas para controlar e avaliar possíveis contaminações (ou seja, mudança de cor do meio). NOTA: As explantas de retina podem ser mantidas na cultura por pelo menos 2 semanas12.</li>
</ol>3. Após a colheita
NOTA: Explantas podem ser usadas para diferentes aplicações experimentais (mancha ocidental, histologia, montagens inteiras, análise genética, eletrofisiologia). Dependendo da aplicação, as explanações organotípicas da retina podem ser congeladas, diluidas ou preparadas para a crioseção. Os passos abaixo descrevem a preparação histológica.
<ol><li>Realize uma fixação de 45 min com 4% de paraformaldeído (PFA), seguido de crioproteção gradual de sacarose (10% de sacarose por 10 min, 20% para 20 min e 30% para 2h em temperatura ambiente (RT) ou durante a noite (ON) a 4 °C). Adicione esses buffers diretamente no poço.</li>
	<li>Corte a membrana ao redor das explantas da retina.</li>
	<li>Incorpore a membrana e o tecido da retina no meio para tecido congelado.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig01.jpg"> Figura 1: Procedimento passo a passo para a preparação de culturas organotípicas de explant retina. (A) Os olhos do rato são enucleados e transferidos para uma solução de proteinase K para permitir a separação de esclera e coroide da retina e RPE. Um pequeno corte na camada esclera/coroide é introduzido. (B) Dois fórceps são usados para descascar a camada esclera/coroide. (C) A camada coroide preta pode ser vista durante o peeling. O epitélio de pigmento de retina escura sublinhado (RPE) permanece preso ao globo ocular. A esclera e o coroide são removidos junto com o nervo óptico. (D) A lente e o vítreo são extraídos com fórceps.  O corpo ciliar restante é removido. (E) A retina mantém uma forma semelhante a uma tigela. (F) Para achatar a retina para a colheita em um prato, 4 cortes em igual distância ao redor da retina são feitos com uma tesoura, dando-lhe uma forma de trevo. A cultura da retina é transferida para uma inserção de cultura de membrana em uma placa de 6 poços com o uso de uma ponta de pipeta de 1 mL cortada. A retina ainda retém um pouco da forma da tigela. No entanto, após a remoção do excesso de líquido ao redor da retina, ele se desdobrará para uma estrutura planar. (G) Na configuração da membrana de cultura, a cultura da retina está repousando sobre uma membrana porosa de policarbonato (PC) em cima de uma solução de meio R16 completo. Para garantir a viabilidade, a cultura deve ser mantida em uma incubadora estéril umidificada a 37 °C com 5% de CO2, e o meio deve ser substituído a cada 48 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura</a>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo apresentado descreve culturas organotípicas de explantagem organotípica de retina de camundongos com RPE intacto em meio R16 definido, livre de soro e antibióticos. Este protocolo foi originalmente desenvolvido a partir do final da década de 19807,28 e desde então tem sido continuamente refinado6,11,12. Aplicações notáveis incluem estudos sobre os mecanismos de degeneração da retina hereditária e a identificação de medicamentos retinoprotetores23,29,30.
Para um experimento bem-sucedido, algumas considerações importantes precisam ser levadas em conta. Aqui estão alguns pontos importantes de solução de problemas para ajudar a melhorar a qualidade das culturas. Em primeiro lugar, as culturas da retina podem apresentar dobramento excessivo e/ou formação de roseta31. Isso pode ser causado por tocar a retina com um fórceps durante o procedimento de explantação. Além disso, o corpo ciliar deve ser completamente removido da explanta, pois isso pode aumentar a dobra da retina durante a cultura. Em segundo lugar, durante a transferência da retina para a placa do poço em uma gota pendurada, se a retina enfrentar a membrana do lado errado para baixo, mantenha-a na gota pendurada na ponta da pipeta e empurre suavemente o meio para dentro e para fora da ponta (sem desprender a gota de suspensão) para virar a retina ao redor. Finalmente, se o RPE permanecer ligado à esclera e se desprender da retina, é provavelmente causado por uma predigesção insuficiente da esclera. Esse problema pode ser especialmente importante quando se trabalha com olhos de animais mais velhos ou espécies não-roedores (por exemplo, porcos) e pode ser resolvido aumentando a concentração de proteínas.
A realização de culturas organotípicas de explant retina é um procedimento complexo que requer treinamento e experiência adequados. A falta de treinamento pode levar à variabilidade na qualidade das explantas da retina. Por essas razões, é importante monitorar e verificar a viabilidade e a reprodutibilidade, caracterizando, por exemplo, a taxa de morte celular com o ensaio TUNEL. O uso de um meio livre de antibióticos torna as explantas da retina vulneráveis à contaminação por bactérias e fungos. Para minimizar esse risco, recomendamos que se seja tomado um cuidado especial para trabalhar em condições verdadeiramente assépticas. Outra limitação da cultura in vitro da retina são as diferenças no ambiente fisioquímico quando comparadas com a retina in vivo (por exemplo, fonte sanguínea choroidal e retina, níveis de oxigênio e glicose, pressão intraocular, composição do vítreo). Um sistema contínuo de perfusão, talvez incorporado em um bioreatordedicado 32 poderia tornar este modelo mais próximo da condição in vivo. Além disso, a axotomia do nervo óptico durante a dissecção da retina levará à morte celular de gânglio, que pode induzir respostas ao estresse8. Portanto, é recomendável que a explanta seja deixada para se adaptar às condições de cultivo por pelo menos 2 dias in vitro antes de ser submetida a uma manipulação ou tratamento específico.
O método descrito é geralmente realizado em tecidos imaturos da retina, que podem sobreviver bem por 4 semanas in vitro7,33. No entanto, o procedimento é adaptado para uma variedade de aplicações, incluindo a cultura de retina adulta. Embora diferentes abordagens publicadas descrevam o isolamento da retina adulta sem seu RPE34,35, a incubação com solução de papain por até 1 h a 37 °C antes da dissecção permite que o RPE fique preso à retina mesmo quando derivado de um rato adulto36.
O meio sem soro e o ambiente in vitro quimicamente definido proporcionam uma manipulação totalmente definida e reprodutível das condições experimentais. Portanto, as culturas organotípicas de explantização da retina são ferramentas valiosas no campo da oftalmologia e neurociência, e têm sido utilizadas para estudar doenças da retina37,desenvolvimento da retina38,39,terapia de células-tronco da retina40,modificações genéticas41e triagem farmacológica. Como exemplo específico de teste de drogas, aqui usamos culturas de explant da retina para testar um análogo cGMP (CN003), conhecido por reduzir a morte celular fotorreceptora em modelos animais para doença de retina hereditária23 (Figura 3B). Outra possível aplicação da técnica é descrita na Figura 3C,que ilustra como o controle preciso do ambiente tecidual pode ser explorado para emular condições diabéticas24. Devido à preservação da arquitetura tecidual durante todo o período de cultivo, as culturas organotípicas de explant da retina também são adequadas para estudos eletrofisiológicos. A funcionalidade neuronal em explantas de retina tem sido investigada usando a gravação de patch-clamp42 e multi-eletrodo-array (MEA) gravando33,43. Este último permite o registro da atividade elétrica das populações neuronais ao mesmo tempo e tem sido explorado para caracterizar a funcionalidade de células fotorreceptoras e gânglios em condições culturais. Em uma perspectiva mais ampla, os sistemas organotípicos de cultura explant também podem ser aplicados em pesquisas pré-clínicas, onde culturas de explant foram utilizadas para testar a eficácia terapêutica da hipotermia44.
A técnica de cultivo de plantas organotípicas é relativamente simples de realizar e, quando comparada aos experimentos in vivo correspondentes, é menos cara e demorada, e evita as preocupações éticas relacionadas aos estudos em animais vivos. O controle preciso sobre as condições experimentais e a preservação da RPE e da complexidade tecidual fazem do método uma ferramenta valiosa para melhorar nosso conhecimento sobre fisiologia da retina e fisiopatologia e possibilitar inúmeras aplicações experimentais.

Em pesquisas oftálmicas, uma variedade de modelos estão disponíveis para estudar a retina, incluindo culturas primárias de células da retina, linhas celulares derivadas da retina, organoides de retina e modelos in vivo animais1,2,3,4,5. No entanto, cada um desses modelos sofre de desvantagens. Por exemplo, as células crescem isoladamente enquanto a retina é uma rede complexa com uma infinidade de interações célula-célula. Assim, o comportamento das culturas celulares isoladas é provável que seja artificial em comparação com o observado em todo um tecido. Esse problema pode, em parte, ser remediado usando organoides in vitro diferenciados da retina, que podem ser usados para estudar o desenvolvimento e a biologia básica6. No entanto, a partir de hoje, a geração organoide da retina ainda é demorada, intensiva em mão-de-obra, e sofre de problemas de reprodutibilidade, exigindo um trabalho substancial de desenvolvimento antes que os organoides possam ser usados para pesquisas translacionais da retina. Finalmente, estudos sobre animais vivos, embora indiscutivelmente o modelo que se aproxima mais dos requisitos da pesquisa oftalmóica, estão associados a fortes preocupações éticas. Um bom compromisso entre a eficiência dos sistemas de cultura celular e a situação real dos modelos in vivo animais são culturas organotípicas de explant retina. Tais culturas também reduzem o sofrimento animal, uma vez que não são realizadas intervenções in vivo.
Vários métodos foram descritos para a cultura de explanações de retina de diferentes espécies5,7,8. Nosso protocolo descreve uma técnica para o isolamento da neuroretina do camundongo juntamente com seu epitélio pigmento retiniano (RPE). Esta técnica também será adequada para culturas de retina de ratos9. A cultura da neuroretina junto com seu RPE é de grande importância para o sucesso. O RPE realiza funções essenciais para a retina: transporte de nutrientes, íons, água, absorção de luz e proteção contra fotooxidação, re-isomerização de toda trans-retinal em 11-cis-retinal, que é crucial para o ciclo visual, fagocitose de membranas fotorreceptoras de galpão, e secreção de fatores essenciais para a integridade estrutural da retina10. A manutenção do RPE permite um desenvolvimento bem-sucedido de segmentos externos e internos fotorreceptor, mantendo a retina viável por mais tempo11. O procedimento descrito abaixo preserva as características histópicas e fisiológicas da retina por pelo menos duas semanas12. Além disso, a cultura das explanações de retina organotípicas em meio livre de soro e sem antibióticos evita a presença de substâncias desconhecidas e permite uma interpretação direta dos resultados12.
As culturas organotípicas de explantamento da retina têm sido essenciais para melhorar nosso conhecimento sobre desenvolvimento da retina e degeneração7,13,14. Mostramos aqui que eles também são uma ferramenta útil para a triagem farmacológica e que eles podem ser empregados para modelar uma variedade de doenças da retina, incluindo a retinopatia diabética.

<table><tbody><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>(+/-)-&amp;alpha;-LipoicAcid (=Thiotic acid)</td><td>Sigma</td><td>T1395</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>CDP-Choline-Na</td><td>Sigma</td><td>30290</td><td></td></tr><tr><td>Corticosterone</td><td>Sigma</td><td>C2505</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;times; 5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>C8027</td><td></td></tr><tr><td>DL-Tocopherol</td><td>Sigma</td><td>T1539</td><td></td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Sigma</td><td>E0135</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur BT100, 1L, 0.2&amp;micro;m</td><td>SARSTEDT</td><td>83.3942.101</td><td>for Basal Medium</td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>F.S.T</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>L-CysteineHCl</td><td>Sigma</td><td>C7477</td><td></td></tr><tr><td>Linoleic Acid</td><td>Sigma</td><td>L1012</td><td></td></tr><tr><td>Linolenic Acid</td><td>Sigma</td><td>L2376</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;x 4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M5005</td><td></td></tr><tr><td>Na-pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P3662</td><td></td></tr><tr><td>NaSeO&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;x 5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic microscope scaping spoon</td><td>F.S.T.</td><td>10360-13</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>21935025</td><td>44 mAnson U/mg</td></tr><tr><td>R16</td><td>Gibco</td><td>07491252A</td><td></td></tr><tr><td>Retinol</td><td>Sigma</td><td>R7632</td><td></td></tr><tr><td>Retinyl acetate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R7882</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>F.S.T</td><td>15004-08</td><td></td></tr><tr><td>Sterile filter 0.22&amp;micro;m</td><td>MILLEX GP</td><td>SLGP033RS</td><td>for supplements</td></tr><tr><td>T3&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Tocopherylacetate</td><td>Sigma</td><td>T1157</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1283</td><td></td></tr><tr><td>Transwell permeable supports</td><td>Corning</td><td>3412</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin B1</td><td>Sigma</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin B12</td><td>Sigma</td><td>V6629</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin C</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr></tbody></table>

long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium

Na pesquisa oftalmica, há uma forte necessidade de modelos in vitro da neuroretina. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a cultura organotípica daretina neurodo camundongo com epitélio pigmento de retina intacto (RPE). Dependendo da questão da pesquisa, as retinas podem ser isoladas de animais do tipo selvagem ou de modelos de doenças, para estudar, por exemplo, retinopatia diabética ou degeneração da retina hereditária. Olhos do início do pós-natal 2-9 animais são enucleados sob condições assépticas. São parcialmente digeridos em proteinase K para permitir um descolamento do coroide do RPE. Sob o estereoscópio, uma pequena incisão é feita na córnea criando duas bordas de onde o coroide e esclera podem ser suavemente descascados do RPE e neuroretina. A lente é então removida, e a pálpebra é cortada em quatro pontos para dar-lhe uma forma de quatro cunhas semelhante a uma folha de trevo. O tecido é finalmente transferido em uma gota de enforcamento em uma inserção de cultura celular segurando uma membrana de cultivo de policarbonato. As culturas são então mantidas em meio R16, sem soro ou antibióticos, em condições totalmente definidas, com uma mudança média a cada dois dias.
O procedimento descrito permite o isolamento da retina e a preservação de seu contexto fisiológico normal e histotípico para períodos de cultivo de pelo menos 2 semanas. Essas características tornam as culturas de explantização da retina organotípica um excelente modelo com alto valor preditivo, para estudos sobre desenvolvimento da retina, mecanismos de doença e eletrofisiologia, ao mesmo tempo em que permitem o rastreamento farmacológico.

Após seguir o protocolo, explanações de retina dissecadas e cultivadas preservam sua arquitetura de tecido normal, com camadas distintas, do RPE à camada de células gânglios (GCL), como mostra a Figura 2. A camada nuclear externa (ONL) e o tamanho da camada nuclear interna (INL) permaneceram principalmente estáveis por 2-3 semanas, com uma perda celular em progresso lento e a redução gradual dessas camadas se tornando cada vez mais aparente se o período de cultivo for prolongado para 4 semanas e além. Na GCL, em contraste, por causa da axotomia do nervo óptico, um afinamento acentuado é geralmente observado nos primeiros 4 dias de cultivo. Posteriormente, a população de células remanescentes no GCL (células amacrinas deslocadas) continuará a ser viável por mais 3-4 semanas17,18,19.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig02.jpg"> Figura 2: Tipos celulares encontrados na cultura da explant da retina. A cultura de explantamento de retina em P11 derivada de animais mutantes rd1 (A) e WT(B) mostrando coloração nuclear com DAPI (esquerda, azul), fotorreceptores de vara (centro, vermelho) e células Müller (direita, verde). A coloração nuclear destaca todas as principais camadas celulares da retina, tais como, epitélio de pigmento da retina (RPE), camada nuclear externa (ONL), camada nuclear interna (INL) e camada celular de gânglio (GCL). Tipos de células específicas nas camadas nucleares, como varas e células Müller, são imunolabeled com prisão alfa em26 e sitese glutamina27 anticorpos, respectivamente. (C) Mostra a seção de comprimento total de uma retina inteira do rato   RD1, com a coloração DAPI destacando a consistência, integração e desenvolvimento da retina. Essas retinas foram cultivadas por 6 dias. Descrição do procedimento: Retina e RPE derivados de animais rd1 ou WT foram isolados em P5 e cultivados como descrito no protocolo, até P11 com uma alteração média a cada 48 h. As culturas foram fixadas com 4% de PFA na P11 e criosectionadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig02large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura</a>
O meio sem soro e o ambiente in vitro sustentado permitem ter controle total sobre as condições experimentais. Aqui, fornecemos dois exemplos para aplicações específicas deste protocolo. O primeiro exemplo ilustra a possibilidade de usar explanações de retina para testes ou rastreamento de drogas. As culturas organotípicas de explant de retina foram preparadas a partir de modelos de camundongos do tipo selvagem (WT) e rd1. Este último é um modelo bem caracterizado para degeneração da retina15. Na retina do rato rd1, a degeneração ONL é desencadeada por níveis anormalmente altos de cGMP em fotorreceptores de vara6,20. O CGMP excessivo causa aumento da atividade dos canais de íons fechados nucleotídeos cíclicos (CNGCs) e da quinase proteica dependente de CGMP (PKG), levando à morte celular21. O tratamento de retinas de camundongos rd1 com um análogo estrutural ao cGMP (nucleotídeo cíclico #3; CN003), que tem como alvo pkg e CNGC, foi testado. Após a explantação em P5, seguiu-se o paradigma de tratamento descrito na Figura 3A. As culturas explant foram fixadas com 4% de PFA na P11 e preparadas para o criosectioning(Figura 3A). Para avaliar a morte celular de seções histológicas de amostras tratadas, não tratadas (NT) e WT,foi realizado um ensaio terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL). A análise das células rotuladas tunel mostrou uma alta porcentagem de células moribundas no ONL dos espécimes não tratados rd1, enquanto o CN003 protegeu os fotorreceptores do rato rd1 quando aplicados a uma concentração de 50 μM23 (Figura 3B).
Uma complicação frequente do diabetes é a retinopatia diabética, uma doença cegante que é difícil de reproduzir fielmente nos modelos animais5. O segundo exemplo destaca o uso de culturas organotípicas de explant retina para caracterizar a viabilidade celular da retina em condições que emulam diabetes mellitus tipo 2 (T2DM)24. Aqui, usamos 20 mM do inibidor de glicolise 2-desoxy-glicose (2-DG)25 e administrámo-lo ao meio de cultura por 24 horas de P10 a P11. Mostramos que submeter explanações de retina WT a tais condições diabéticas simuladas in vitro leva à morte celular neuronal extensiva da retina(Figura 3C). Esse paradigma, por sua vez, pode ser utilizado, por exemplo, para estudar mecanismos degenerativos ou testar tratamentos retinoprotetores em um contexto de diabetes.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig03.jpg"> Figura 3: Dois exemplos para aplicações de culturas organotípicas de explantamento de retina. (A) Descrição do procedimento: Retina e RPE derivados de animais rd1 ou WT foram isolados no dia pós-natal (P) 5 e cultivados como descrito acima, com uma mudança média a cada 48 h. Em P7 e P9, o meio gasto foi descartado e o cm fresco contendo composto ativo em uma concentração de 50 μM foi adicionado à placa. As culturas foram fixadas com 4% de PFA na P11 e criosectionadas. (B) Teste composto na retina rd1. As seções foram obtidas a partir de culturas de TR, tratadas (003) e não tratadas (NT) de explantagem organotípica da retina. O ensaio TUNEL (vermelho) foi usado como marcador para morte celular. Coloração nuclear com DAPI (azul). A quantificação mostrada no gráfico da barra ilustra as percentagens das células moribundas em WT, rd1 NT e rd1 003 condição. Tratamento com composto 003 reduziu significativamente a morte celular do fotorreceptor rd1. (C) Simulação do diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) na retina WT utilizando tratamento 2-deoxy-glicose (2-DG). O ensaio TUNEL foi realizado em amostras NT e T2DM. A quantificação indica um aumento altamente significativo na morte celular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig03large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura</a>
Tabela S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S1%20-%20Basal%20Medium.doc" target="_blank">Clique aqui para baixar a tabela</a>  
Mesa S2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S2%20-%20Supplements.doc" target="_blank">Clique aqui para baixar a tabela</a>  
Mesa S3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S3%20-%20Complete%20Medium.doc" target="_blank">Clique aqui para baixar a tabela</a>

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Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

O protocolo descreve explanações organotípicas daretina neurodo camundongo, cultivadas juntamente com seu epitélio pigmento retiniano (RPE), em meio definido r16, livre de soro e antibióticos. Este método é relativamente simples de executar, menos caro e demorado quando comparado com experimentos in vivo, e pode ser adaptado a inúmeras aplicações experimentais.

Cultivo de longo prazo, sem soro de explantes de retina de rato organotipo com epitélio pigmento de retina intacto

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.4K visualizações.  University of Tübingen. O protocolo descreve explanações organotípicas daretina neurodo camundongo, cultivadas juntamente com seu epitélio pigmento retiniano (RPE), em meio definido r16, livre de soro e antibióticos. Este método é relativamente simples de executar, menos caro e demorado quando comparado com experimentos in vivo, e pode ser adaptado a inúmeras aplicações experimentais.

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Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental manipulations in ovo/in vivo makes the chicken embryonic retina a versatile and very efficient experimental model. Although the chicken retina is easy to target in ovo by intraocular injections or electroporation, the effective and exact concentration of the reagents within the retina may be difficult to fully control. This may be due to variations of the exact injection site, leakage from the eye or uneven diffusion of the substances. Furthermore, the frequency of malformations and mortality after invasive manipulations such as electroporation is rather high.
This protocol describes an ex ovo technique for culturing whole retinal explants from chicken embryos and provides a method for controlled exposure of the retina to reagents. The protocol describes how to dissect, experimentally manipulate, and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explants can be cultured for approximately 24 hr and be subjected to different manipulations such as electroporation. The major advantages are that the experiment is not dependent on the survival of the embryo and that the concentration of the introduced reagent can be varied and controlled in order to determine and optimize the effective concentration. Furthermore, the technique is rapid, cheap and together with its high experimental success rate, it ensures reproducible results. It should be emphasized that it serves as an excellent complement to experiments performed in ovo.

This protocol describes a method to dissect, experimentally manipulate and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explant cultures are useful when high success rate, efficacy and reproducibility are needed to test the effects of plasmids for electroporation and/or reagent substances, i.e., enzymatic inhibitors.

Os explantes de retina inteiras de frango embriões para tratamentos de reagentes Eletroporação e Chemical

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Biologia do Desenvolvimento

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human retina and is therefore a valuable species for studying mechanisms of human retinal injury and degenerative disease. Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina isolated from eyes obtained from an abattoir. After removing the anterior segment, a trephine blade was used to create multiple neural retina-Bruch's membrane-RPE-choroid-sclera explants from the posterior segment of adult porcine eyes. A piece of sterile filter paper was used to lift the neural retina off from each explant. The filter paper-retina complex was cultured (photoreceptor side up) atop an insert, which was held away from the bottom of the culture dish by a custom-made stand. The stand allows for good circulation of the culture medium to both sides of the retina. Overall, this procedure is simple, reproducible, and permits preservation of native retinal structure for at least seven days, making it a useful model for a variety of morphological, pharmacological, and biochemical studies on mammalian retina.

Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina for seven days. Briefly, a sterile filter paper was used to lift the neural retina off from the RPE and place photoreceptor side up on an insert raised by a custom-made stand.

Cultura organotípicas de Full-espessura Retina Porcina Adulto

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

Neurociência

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

No útero e ex eletroporação in vivo para Expressão Gênica em células ganglionares da retina do rato

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Biologia

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

Definidos Xeno-free e livre de alimentador condições de cultura para a geração de humanos iPSC-derivado da retina célula modelos

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, retina-specific or conditional knockout mouse models often display early lethality or suffer from severe malformations, preventing an analysis beyond embryonic or early postnatal stages.
Primary cell culture is an alternative to investigate the effects of exogenously applied recombinant factors, overexpression of genes or siRNA-mediated gene knockdown in a controlled environment. Dissociated cell culture has the advantage that the endogenous signals reaching the target cells are reduced, thereby facilitating the identification of exogenously triggered effects after pharmacological manipulation. However, important cell-cell interactions are initially destroyed by enzymatic digestion or mechanical dissociation, even if re-aggregated retinospheroid cultures1 are used.
By contrast, organotypic retinal wholemount cultures provide a system close to the physiological in vivo situation with neuronal interactions and connections still preserved2-5.
In this video article we provide a step by step demonstration of (1) the establishment of in vivo-like organotypic retinal wholemount cultures including dissection peculiarities of embryonic, postnatal and adult murine eyes and (2) a dissociation and cytospin procedure for analysis of neuronal apoptosis and retinal cell proliferation in organotypic wholemounts, e.g. after culture in the presence of exogenously applied recombinant factors.

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

This video article demonstrates the establishment of organotypic retinal wholemount cultures and a cytospin procedure for analysis of exogenously induced effects. Organotypic retinal wholemount cultures mimic the in vivo situation and significantly facilitate the accessibility of murine retinas for experimental manipulations while circumventing the disadvantages of classical murine animal models.

In vivo como Cultura Wholemount organotípicas murino da retina

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

Caracterização de uma nova técnica de cultura de retina organotipípica humana

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Medicina

Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate (cGMP)-dependent protein kinase (PKG) pathway in photoreceptor cells causes photoreceptor cell death, especially in models harboring phosphodiesterase 6b (PDE6b) mutations. Previous studies on RD have used mainly murine models such as rd1 or rd10 mice. Given the genetic and physiological differences between mice and humans, it is important to understand to which extent the retinas of primates and rodents are comparable. Macaques share a high level of genetic similarity with humans. Therefore, wild-type macaques (aged 1-3 years) were selected for the in vitro culture of retinal explants that included the retina-retinal pigment epithelium (RPE)-choroid complex. These explants were treated with different concentrations of the PDE6 inhibitor zaprinast to induce the cGMP-PKG signaling pathway and simulate RD pathogenesis. cGMP accumulation and cell death in primate retinal explants were subsequently verified using immunofluorescence and the TUNEL assay. The primate retinal model established in this study may serve for relevant and effective studies into the mechanisms of cGMP-PKG-dependent RD, as well as for the development of future treatment approaches.

Retinal explants obtained from wild-type macaques were cultured in vitro. Retinal degeneration and the cGMP-PKG signaling pathway was induced using the PDE6 inhibitor zaprinast. cGMP accumulation in the explants at different zaprinast concentrations was verified using immunofluorescence.

Culturas organotípicas de explantes da retina de macacos

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular cells. Isolating, culturing, and sustaining retinal neurons in vitro have technical and biological limitations. Culturing retinal explants may overcome these limitations and offer a unique ex vivo model to study the cross-talk between various retinal cells with well-controlled biochemical parameters and independent of the vascular system. Moreover, retinal explants are an effective screening tool for studying novel pharmacological interventions in various retinal vascular and neurodegenerative diseases such as diabetic retinopathy. Here, we describe a detailed protocol for retinal explants' isolation and culture for an extended period. The manuscript also presents some of the technical problems during this procedure that may affect the desired outcomes and reproducibility of the retinal explant culture. The immunostaining of the retinal vessels, glial cells, and neurons demonstrated intact retinal capillaries and neuroglial cells after 2 weeks from the beginning of the retinal explant culture. This establishes retinal explants as a reliable tool for studying changes in the retinal vasculature and neuroglial cells under conditions that mimic retinal diseases such as diabetic retinopathy.

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

This protocol presents and describes steps for the isolation, dissection, culturing, and staining of retinal explants obtained from an adult mouse. This method is beneficial as an ex vivo model for studying different retinal neurovascular diseases such as diabetic retinopathy.

Explante Retiniano da Retina de Rato Adulto como Modelo Ex Vivo para o Estudo de Doenças Neurovasculares da Retina

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular ...

Caracterização e Dinâmica Morfológica de RPE Murino Primário Cultivado

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

Autor em destaque: Isolamento eficiente de células epiteliais pigmentares primárias da retina de camundongos adultos para pesquisa de retinopatia

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Cultivo de longo prazo, sem soro de explantes de retina de rato organotipo com epitélio pigmento de retina intacto

Resumo

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Cultura organotípicas de Full-espessura Retina Porcina Adulto

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In vivo como Cultura Wholemount organotípicas murino da retina

Caracterização de uma nova técnica de cultura de retina organotipípica humana

Culturas organotípicas de explantes da retina de macacos

Explante Retiniano da Retina de Rato Adulto como Modelo Ex Vivo para o Estudo de Doenças Neurovasculares da Retina

Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos

Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos