Agradecemos a Chandran Sabanayagam por sua ajuda no desenvolvimento do sistema, Joshua Edel para aconselhamento sobre a concepção do dispositivo micro e os funcionários do Instituto Rowland na Universidade de Harvard para usinagem de peças da instalação. Reconhecemos discussões úteis com os membros do grupo Meller no Instituto Rowland e na Universidade de Boston, e os membros do grupo T. Ha &#39;s em UIUC para informações úteis. Finalmente, agradecemos o apoio financeiro da National Science Foundation (PHY-0701207) e do Instituto Nacional de Saúde (GM075893).

1 - Montagem da célula microfluídica A célula microfluídica é feita por uma fusão padronizada, 2 mm de espessura, polidimetilsiloxano disco (PDMS) para uma cobertura de vidro de quartzo limpo de fresco. O disco contém quatro PDMS 30 mL câmaras retangulares que são acessados ​​por entrada e saída flexíveis capilares conectados a um reservatório de tampão e uma bomba de seringa, respectivamente, para o fluxo controlado de buffer. A célula de fluxo é suportado em sua parte traseira por uma janela de vidro e colocado em um porta-celular feito sob medida contendo um elemento termoelétrico refrigerado a água para regular a temperatura. <ol><li> Para fazer o padrão PDMS disco, misturar 10 partes de base elastômero de silicone com um agente de cura parte, misture bem e deixe por 1 hora de desgaseificação a vácuo. </li><li> Delicadamente despeje a mistura de elastômero para o molde de células microfluídicos. No nosso caso, este é um um wafer de silício &quot;, com quatro faixas (1x10 1x10 4 x 3 x 300 mm) feita a partir de fotorresiste negativo. Deixe isso para a cura em uma placa quente a 70 ° C por duas horas. </li><li> Retire cuidadosamente o disco PDMS curado do molde utilizando uma lâmina de barbear. Fundir o disco em uma janela de vidro 1&#39;&#39;(contendo 8 x 2 mm de diâmetro pré-furos em ambas as extremidades dos canais) por plasma oxidante ambas as superfícies por 30 segundos. Fusível as janelas de vidro para o lado plano do disco PDMS (o lado que não contenham os canais). </li><li> Inserir um tubo de 2 polegadas de sílica fundida longo e flexível capilar através do orifício de cada janela de vidro, até atingir o canal. Inserção de uma agulha e depois seguir com o capilar pode facilitar este processo. Os orifícios de vidro da janela usando um composto de fundição de cura rápida de silicone tais como Kwik-Cast. </li><li> Enxágüe os canais com etanol e água, e plasma-ativar a célula em conjunto com um recém-limpos, lamínula de 1 polegada circular de quartzo por 30 segundos. Sugerimos a limpeza dessa lamínula usando piranha *. Fundir o lamínula para o lado da célula que contém os canais, de vedação das câmaras. </li><li> Deixe o celular se reuniram para cura de noite à temperatura ambiente. </li></ol> * Piranha é uma solução de H 2 O 2 e H 2 SO 4 em 1:2,5 proporções. Para limpar o lamínulas, mergulha-as na piranha a 90 ° C por 20 min. 2 - Ativação da superfície para imobilização molécula Para estudos de ácido nucléico, o esquema mais simples imobilização de superfície consiste em primeiro revestimento de vidro ou de quartzo com lamínula biotinilado albumina bovina (BSA) e depois com estreptavidina. Isto permite que a amostra biotinilado a ser imobilizada com alta especificidade para os dias em temperatura ambiente. <ol><li> Conectar tubos flexíveis para os capilares para a injecção de buffer fácil usando uma seringa e agulha. </li><li> Injetar uma solução de 0,1 mg / ml de BSA biotinilado em tampão A (10 mM TRIS-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, filtrado através de filtros 0,02 mm) para o canal e incubar por pelo menos 30 min. </li><li> ML de tampão de fluxo 300-500 A para remover qualquer BSA livre biotinilado do canal, tomando cuidado para não prender as bolhas de ar no interior da câmara. </li><li> Injetar uma solução de 0,1 mg / ml de estreptavidina em tampão A e incubar por 15 min. Em seguida, repita a Etapa 3. </li><li> Fluxo através de uma solução pM 05/03 da amostra biotinilado. Realizar um exame de superfície para verificar a cobertura de moléculas fluorescentes. Se necessário, aumentar a concentração da amostra para obter uma melhor cobertura. Incubar por 10 min e repita o passo 3. </li></ol> A célula microfluídica é montado em um palco motorizado xy permitindo movimento (até 25 mm) grossa usando codificada opticamente motores DC, e do movimento (1 nm) bem usando dois acionadores de circuito fechado piezo (Physik Instrumente modelo M-014 ou similar). Isto pode ser feito antes ou após a ativação da superfície para a imobilização da amostra. 3 - Preparar o tampão Imaging (IB) O IB consiste de um sistema enzimático de limpeza de oxigênio e um supressor triplet, como Trolox. Uma vez que o IB é lavada através constantemente durante a noite, pelo menos, 10 ml deve ser preparado com antecedência. <ol><li> Prepare 10 ml de 0,8% w / v D-glicose, pelo menos 35 mM TRIS-HCl pH 8,0 e 50 mM NaCl em água deionizada. A maior concentração de tampão é importante por duas razões: Trolox dissolvendo vai acidificar a solução, ea reação enzimática irá também diminuir o pH da solução ao longo do tempo. Uma vez que esta solução tem uma vida útil longa, pode ser armazenado como uma solução de reserva. </li><li> Dissolver 5 mg de Trolox no buffer preparada na Etapa 1 em vortex por alguns minutos e, em seguida, balançando para&gt; 10 min. Trolox não é muito solúvel em água em pH&gt; 7, por isso não apressar esse passo. Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 mm e deixar de desgaseificação a vácuo por 10 minutos. </li><li> Prepare a solução &quot;gloxy&quot; enzimática através da mistura de 60 mL water, 20 l de tampão 5X A, 20 l de catalase, uma glicose oxidase mg e 100 l de 10 mg / ml BSA. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 mM centrífuga. </li><li> Misture delicadamente o buffer da Etapa 2 com a solução &quot;gloxy&quot; do Passo 3 evitando a formação de bolhas de ar. </li><li> O fluxo IB através do canal a uma taxa constante de 5 mL / min usando uma bomba de seringa mecânicas para controlar a vazão. Bolha de gás argônio para o reservatório IB para evitar que o oxigênio atmosférico de re-dissolvendo-se no buffer. </li></ol> A varredura de superfície, localização molécula e aquisição de traços de intensidade única molécula é controlado por um programa LabView que permite a coleta de dados automatizada 1. O programa verifica 20x20 M 2 áreas em 0,2 mM resolução, com uma taxa de 0,1 mícron / ms. Os dados são processados ​​imediatamente para produzir intensidade ponderadas localizações de todos os pixels acima da contagem de fundo. Uma vez que as moléculas imobilizadas são encontrados, eles são movidos um por um para o volume confocal e as intensidades do doador e receptor fluoróforo são registrados como uma função do tempo até que ambos photobleach fluoróforos. O estágio é então programado para mover para uma nova origem 100 mm de distância, e o processo de digitalização é repetido. 4 - Resultados Representante Abaixo estão algumas imagens que mostram a célula montada microfluídicos antes da ativação da superfície e depois de ser montado no microscópio pronto para imobilização molécula. Se o canal é ativado com sucesso, verifica a superfície deve ser semelhante ao ilustrado abaixo scans mostrando de emissão do doador de corante (verde) e receptor (vermelho) após a excitação do doador direto. Estas moléculas são movidos um por um para o volume de sondagem ea fluorescência é registrado ao longo do tempo até que ambos photobleach corantes, como mostrado nos traços única molécula. A partir de vestígios como estes pode-se obter a eficiência FRET que informa sobre a separação dos doadores aceitador-instantânea, que por sua vez é usado para explorar a estrutura e dinâmica de moléculas de interesse biológico. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /> Figura 1: Célula microfluídica com quatro canais, cada um com entrada / saída capilares. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /> Figura 2: Célula montado no microscópio pronto para medições. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 2. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" border="0" /> Figura 3: Configuração para sm-FRET medições. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 3. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="Figura 4" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="Figura 5" border="0" /> Figuras 4 e 5: canal vermelho e verde de um exame de superfície de imobilizado FRET moléculas animado com laser verde. Clique para ver uma versão maior da <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">figura 4</a> , ou <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">a figura 5</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="Figura 6" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="Figura 7" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="Figura 8" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="Figura 9" border="0" /> Figuras 6, 7, 8 e 9: trajetórias Intensidade do doador (verde) e receptor (vermelho) fluoróforos rotulados a uma molécula de DNA 8, 10, 16 e 18 pares de bases de distância. Clique para ver uma versão maior da <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">figura 6</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">figura 7</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">figura 8</a> , ou <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">a figura 9</a> .

<ol>
	<li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Techniques,+a+Laboratory+Manual.">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li><li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis.">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li><li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules:+Corrections+due+to+nonideal+transfer.">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li><li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments.">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy.">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li><li>Di Fiori, N., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Article in preparation. , .</li></ol>

Embora o protocolo acima foi optimizado para o nosso sistema em particular e para uma escolha específica de corantes (TMR e ATTO647N), é de modo algum o único método provado. Recentemente, um sistema de oxigênio alternativa limpeza composto de ácido protocatecuico (PCA) / ​​protocatechuate-3 ,4-dioxigenase (PCD) foi mostrado para aumentar a fotoestabilidade de determinados corantes 4. Da mesma forma, outros triplet estado quenchers tais como β-mercaptoetanol (BME) pode ser usado em vez de Trolox, embora estes não podem suprimir de longa duração piscar de alguns corantes, em particular Cy5 5. Apesar de imobilização via biotina-estreptavidina-biotina albumina bovina (BSA) é a escolha preferida para estudos ácidos nucléicos, um polietileno glicol (PEG) com revestimento de superfície é mais adequado para estudos de proteínas, uma vez que impede não-específica de adesão 1. Além disso, sub-difração limitada vesículas tamanho pode ser usado para encapsular a biomolécula de interesse nos casos em que pode ser afetada por interações de superfície 6. Neste artigo nós usamos uma configuração confocal equipado com fotodiodos avalanche de silicone para adquirir os traços intensidade de fluorescência. Este protocolo funciona igualmente bem com a Total microscópios reflexão interna de fluorescência (TIRF) equipados com câmeras CCD. Independentemente da microscopia utilizadas, sm-FRET pode informar sobre resoluções espaciais aproximando do angstrom, quando o doador eo receptor de sinal estão devidamente corrigido 7.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>TSP150375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica cover slip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Esco Products</td>
<td>R425000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diba Industries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8549</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9085</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>0021122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DowCorning</td>
<td>3097366-1004</td>
<td>Silicone Elastomer Kit</td>
</tr>
<tr>
<td>Trolox</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aldrich</td>
<td>238813</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C3155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose Oxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kwik-Cast Sealant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>Kwik-Cast</td>
<td>Silicone Casting Compound</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules

Fluorescência Resonance Energy Transfer (FRET) microscopia tem sido amplamente utilizada para estudar a estrutura e dinâmica de moléculas de interesse biológico, tais como ácidos nucléicos e proteínas. Única molécula FRET (sm-FRET) medições em moléculas imobilizadas permitir observações longo do sistema de forma eficaz até que ambos os corantes photobleach, resultando em tempo de traços que o relatório sobre a dinâmica biomolecular com uma ampla gama de escalas de tempo de milissegundos para minutos. Para facilitar a aquisição de grande número de vestígios de análises estatísticas, o processo deve ser automatizado e ao meio ambiente amostra deve ser rigidamente controlado sobre o tempo de medição inteira (~ 12 horas). Isso é feito usando um microscópio de varredura confocal automatizada que permite o interrogatório de milhares de moléculas individuais durante a noite, e uma célula microfluídicos que permite a troca de tampão controlada, com teor de oxigênio restrito e mantém uma temperatura constante durante todo o período de medição. Aqui nós mostramos como montar o dispositivo micro e como ativar a sua superfície para imobilização de DNA. Então nós explicamos como preparar um tampão para maximizar a fotoestabilidade e duração da fluoróforos. Finalmente, vamos mostrar os passos envolvidos na preparação da instalação para a aquisição automatizada de molécula tempo resolvido única FRET traços de moléculas de DNA.

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Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Neste artigo vamos descrever como obtemos FRET traços de moléculas individuais de DNA imobilizado em uma superfície usando um microscópio de varredura confocal automatizado.

Sistema automatizado para medições única molécula de fluorescência de Superfície-imobilizada Biomoléculas

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

automated-system-for-single-molecule-fluorescence-measurements

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K visualizações.  Boston University. Neste artigo vamos descrever como obtemos FRET traços de moléculas individuais de DNA imobilizado em uma superfície usando um microscópio de varredura confocal automatizado.

Vídeo: Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Métodos única molécula para acompanhar as alterações nas propriedades elásticas bicamada

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Biologia

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Única molécula-Imaging dos Transportes Nuclear

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

Estudar DNA Looping por Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Open Source Análise alta Conteúdo Utilizando Automated microscopia de fluorescência Lifetime Imagiologia

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Método para a rotulagem transcritos em células individuais Escherichia coli para único-molécula fluorescência In Situ as experiências de hibridação

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

Imagem de fluorescência para a reconstrução da único-partícula de Chlamydomonas centríolos e isolamento

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing the innate cellular fluorescence signature from each individual live cell in a population distributed in a three-dimensional (3D) space. The innate fluorescence signature of a cell is a collection of fluorescence signals emitted by various biomolecules within the cell. Previous studies established that innate fluorescence signatures reflect various cellular properties and differences in physiological status and are a rich source of information for cell characterization and identification. Innate fluorescence signatures have been traditionally analyzed at the population level, necessitating a clonal culture, but not at the single-cell level. CRIF is particularly suitable for studies that require 3D resolution and/or selective extraction of fluorescence signals from individual cells. Because the fluorescence signature is an innate property of a cell, CRIF is also suitable for tag-free prediction of the type and/or physiological status of intact and single cells. This method may be a powerful tool for streamlined cell analysis, where the phenotype of each single cell in a heterogenous population can be directly assessed by its autofluorescence signature under a microscope without cell tagging.

Here, a protocol is presented for optically extracting and cataloging innate cellular fluorescence signatures (i.e., cellular autofluorescence) from every individual live cell distributed in a three-dimensional space. This method is suitable for studying the innate fluorescence signature of diverse biological systems at a single-cell resolution, including cells from bacteria, fungi, yeasts, plants, and animals.

Reconstrução de assinaturas de fluorescência inata de células únicas por microscopia confocal

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

Ensaio cinético de molécula única de alta produtividade paralela para decote de DNA específico do local

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...