As membranas celulares são altamente lotadas devido à presença de proteínas e açúcares incorporados. Demonstramos imagens de molécula única em bicamadas lipídicas sintéticas com aglomeração. Esta plataforma é útil para investigar o efeito do apinhamento nas reações biomoleculares da membrana, a nível molecular.
O protocolo explica a análise de ligação, difusão e montagem de biomoléculas de membrana. O sucesso no experimento depende da limpeza rigorosa do substrato, evitando danos à bicamada e mantendo uma alta relação sinal-ruído em imagens de molécula única. Demonstrando o procedimento comigo está Aditya Upasani e Vishwesh Haricharan Rai, estudantes de pós-graduação do laboratório.
Comece colocando a lâmina de acrílico tratada com plasma em papel de seda limpo. Descasque a fita de corte a laser de dupla face e cole-a na lâmina. Usando uma ponta de pipeta, achate a fita para evitar vazamentos de um canal para o outro.
Feche a câmara colocando a tampa tratada com plasma na lâmina gravada. Usando uma ponta de pipeta, pressione suavemente a tampa nas regiões coladas para tornar o canal à prova d'água. Se estiver usando lâminas de vidro, sele as bordas usando resina epóxi.
Armazene as câmaras de imagem microfluídicas preparadas por uma a duas semanas sob condições dessecadas. Pegue um frasco para injetáveis de vidro pré-limpo com solução de piranha e adicione a solução de clorofórmio de POPC e DOPE-PEG(2000) na fração molar desejada de lípidos PEG 2000 para obter a concentração lipídica final de três milimolares, após a adição do tampão. Da mesma forma, outras composições de membrana de lipídios podem ser preparadas.
Em seguida, seque o clorofórmio do frasco para injetáveis utilizando um fluxo suave de azoto com um pequeno redemoinho para que os lípidos desejados sejam uniformemente revestidos na superfície do frasco para injetáveis. Remova o clorofórmio residual mantendo o frasco para injetáveis num exsicador a vácuo durante uma hora. Em seguida, adicione um mililitro de PBS ao frasco para injetáveis e incube durante a noite a 37 graus Celsius.
Após a incubação durante a noite, vórtice suave o frasco para injetáveis durante um a dois minutos até que a solução se torne turva e leitosa. Agora transfira 100 microlitros desta solução para um pequeno tubo de centrífuga de 500 microlitros. Para gerar pequenas vesículas unilamelares de 50 a 100 nanômetros de diâmetro, sonicate a solução por cerca de uma hora em um sonicator de banho.
No final da sonicação, a solução se tornará clara, se a solução ainda estiver turva, sonicate por mais 30 minutos. Em seguida, adicione cloreto de cálcio às vesículas sonicadas a uma concentração final de 30 milimolares na solução lipídica. Corte uma ponta de micropipeta para injetar a solução de amostra para que ela se encaixe firmemente no orifício.
Misture a solução lipídica e injete-a através de um dos orifícios na câmara de imagem. Limpe o excesso de solução que sai da câmara da saída com tecido limpo para evitar a contaminação dos canais adjacentes. Prepare uma câmara de umidificação colocando tecido molhado no final de um tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Coloque o slide no tubo e feche a tampa do tubo. Coloque o tubo de lado e deixe este conjunto em uma câmara umidificada por 90 minutos, de preferência em uma incubadora a 37 graus Celsius. Lave bem a câmara com uma grande quantidade de tampão PBS, evitando que as bolhas de ar entrem na câmara durante a lavagem, pois isso pode gerar defeitos na membrana.
Antes de realizar qualquer experimento sobre mobilidade e montagem, alinhe o microscópio TIRF preparando uma amostra de contas fluorescentes e adicionando-as ao canal microfluídico em baixas concentrações, de modo que as manchas fluorescentes de contas únicas não se sobreponham nas imagens. Primeiro, visualize as contas no modo de epifluorescência. Enquanto a iluminação estiver no modo de epifluorescência, mova o espelho M5 sentado em um estágio de tradução de tal forma que o feixe que sai da objetiva se dobre até que a configuração de reflexão interna total seja alcançada.
Para verificar se a iluminação TIR foi alcançada, verifique se apenas as contas na superfície são visíveis quando o campo evanescente TIR está iluminando a amostra de contas e se as contas flutuantes livres longe da superfície não são observadas. No início do experimento, defina a potência do laser no plano focal traseiro objetivo para cinco a 10 miliwatts para evitar a destruição da foto dos fluoróforos. Mantenha a lâmina no estágio do microscópio e concentre-se na membrana nua primeiro, pequenos traços de impurezas nas membranas lipídicas são suficientes para visualizar a membrana.
Injete a amostra usando uma micropipeta na câmara de imagem revestida com PEG SLB. Para medir a cinética de ligação de uma única molécula, use uma bomba de seringa para fluir as biomoléculas marcadas através dos orifícios de entrada para a câmara microfluídica a uma taxa de fluxo de 50 a 500 microlitros por minuto. Para gravar 5.000 quadros a 25 a 50 quadros por segundo, defina os parâmetros de aquisição de filmes necessários.
Inicie a aquisição do filme e adquira mais de 5.000 quadros sob fluxo contínuo da bomba da seringa até que não haja aumento adicional no aparecimento de novas manchas na superfície da membrana, e analise a cinética de ligação conforme descrito no manuscrito. Para o rastreamento de partículas únicas, adicione as biomoléculas marcadas em baixas concentrações ao canal usando uma micropipeta. Para garantir a alta fidelidade das trilhas recuperadas dos conjuntos de dados, otimize a concentração para uma densidade inferior a 0,1 partículas por micrômetro quadrado, de modo que as partículas individuais raramente se cruzem.
Se necessário, incube a câmara em um ambiente de umidificação e lave com o tampão antes da imagem. Para a análise da trajetória de uma única partícula, adquira de 200 a 500 quadros a 10 a 100 quadros por segundo e mantenha a lente objetiva focada no plano da bicamada com o mínimo de desvio de estágio durante a aquisição da imagem. Para subunidades de medição, adicione a concentração relevante de biomoléculas marcadas à câmara de imagem microfluídica e incube a lâmina em uma câmara de umidificação na temperatura desejada pelo tempo necessário.
Antes da imagem, lave a câmara de imagem com um tampão. Coloque a lâmina em um microscópio e ajuste o foco para visualizar as moléculas marcadas. Defina a potência do laser para um nível em que o branqueamento do fluoróforo ocorra gradualmente.
Idealmente, para cada complexo montado controle a potência do laser para manter a taxa de escalonamento da foto entre 10 a 20 quadros de distância, conforme descrito no manuscrito, e adquirir as imagens até que todas as moléculas estejam completamente branqueadas por foto. Execute uma medição de montagem dependente do tempo, iniciando a aquisição do filme assim que a amostra for introduzida na câmara e adquirindo novos filmes de fotobranqueamento em intervalos de tempo fixos após a ligação da membrana de diferentes segmentos do PEG SLB. A ligação da citolisina A às membranas lipídicas com cinco moles por cento DOPE-PEG(2000) apresentou aumento da densidade de partículas e saturação atingida.
Uma função de decaimento exponencial ajustada às partículas ligadas dá a constante de tempo para a ligação da membrana da citulisina A. Sem qualquer polímero PEG na membrana, a maioria dos traçadores exibia difusão restrita em SLBs. Pequenos níveis de PEG 2000 na bicamada da membrana se afastavam da superfície subjacente, permitindo que as moléculas traçadoras se difundissem sem restrições de superfície.
No entanto, o confinamento extremo é observado em uma alta concentração de PEG na membrana de bicamada. A distribuição ISD2 para a difusão do traçador de DNA lipofílico em duas membranas lipídicas diferentes do PEG 2000 mostrou diminuição da mobilidade em altas concentrações de PEG. Após incubação na membrana de bicamada lipídica lotada, a citolisina A exibiu muitas etapas distintas de fotobranqueamento, sugerindo a formação de vários intermediários de montagem.
Após correção para a eficiência de marcação, a distribuição final dos oligômeros mostrou a espécie de citolisina A dodecamérica como estrutura dominante. A montagem da ligação às proteínas da membrana e outras reações devem ser realizadas em ambientes apropriados de apinhamento da membrana. Deve-se prestar atenção à limpeza da câmara de imagem, evitando interromper a bicamada e configurando o microscópio TIRF.
