Agradecemos a drs. Yuh-Nung Jan e Wes Grueber para a prestação de stocks voar utilizados neste estudo. Os autores agradecem o F. Thomas e Kate Miller Jeffress Memorial Trust para o apoio desta pesquisa (DNC) e do Gabinete do Reitor da Universidade George Mason da (EPRI).

Comentários gerais sobre classificação Bead Magnética de Neurônios Drosophila periférica (tempo total para a Conclusão do Protocolo: 2,5-3 horas) Procedimentos de laboratório padrão para manter um ambiente limpo e livre de RNAse devem ser observados em todos os momentos para prevenir a degradação do RNA. Quando a Drosophila cutícula larval é dissecada e colocada no buffer de células dissociação, os neurônios periféricos são uma das células último a destacar do cutícula. Nós exploramos esta propriedade e projetado este protocolo para remover a maior parte das células não-específicas da cutícula, como músculo e gordura antes de isolar os neurônios da. Com a prática, o protocolo de toda pode ser concluída com êxito em aproximadamente 2,5 horas. A preparação de contas revestidas de anticorpo deve ser concluída antes do experimento começa. 1. Preparando esferas magnéticas para Células Encadernação: Esta etapa deve ser concluída antes do início do experimento. As contas preparadas podem ser preparados e armazenados a 4 ° C até ser necessário. <ol><li> Lavar 100 l de contas Dynabeads M-280 Estreptavidina revestido três vezes em PBS pela ressuspensão em 500 mL de PBS fresco e peletização-lo em um campo magnético forte a cada vez. </li><li> Finalmente voltar a suspender as contas diretamente em 100 ul de undiluted biotinilado anticorpo anti-mouse-CD8a rato (concentração de anticorpos é 100 mg / ml). </li><li> Incubar a mistura por 1 hora no gelo com vórtex leve ocasional para evitar sedimentação. [1 mL de Dynabeads M-280 pode ligar 0,05-0,10 mg de anticorpo biotinilado]. </li><li> Lave a mistura do grânulo-anticorpo três vezes como descrito no passo 1.1 para remover o excesso de anticorpo. O esferas magnéticas são agora revestidas com anticorpos e pronto para ser usado. Armazenar a mistura do grânulo-anticorpos em 100 l de 1X PBS a 4 ° C até o uso. </li></ol> 2. Selecionar e lavar Larvas: (10-15 minutos) <ol><li> Escolha 30-50 anos combinados larvas de terceiro estádio e colocá-los em um tubo de microcentrífuga 1,6 ml com 1-1,2 ml de fosfato 1X Buffered Saline (PBS). (3-5 minutos) </li><li> Fechar o tubo e vortex-lo no ajuste máximo três vezes por 1 segundo cada. </li><li> Usando um fogo-polido pipeta Pasteur desprezar o sobrenadante completamente. Repita a lavagem (2.1) e vortex (2.2) passos 3-4 vezes até que o sobrenadante é visivelmente clara de todas as partículas de alimentos e detritos. </li><li> Brevemente repetir a lavagem com 1 ml de etanol 70% e desprezar o sobrenadante. </li><li> Lavar as larvas duas vezes com 1 ml de ddH2O e desprezar o sobrenadante. </li><li> Brevemente repetir a lavagem mais uma vez com 1 ml de RNase-AWAY e desprezar o sobrenadante. </li><li> Lavar as larvas três vezes em 1 ml de ddH2O para assegurar a remoção completa de RNase-AWAY. </li></ol> 3. Dissecção: (10-12 minutos) <ol><li> 12/10 larvas lugar no centro de uma placa revestida 35 milímetros Sylgard Petri. Posicioná-los um pouco longe um do outro. [Passo Crítico: Descarte qualquer larvas que não parecem estar no estágio apropriado de desenvolvimento] </li><li> Cortado a ponta anterior das larvas usando um par de tesouras de dissecação muito bem para todas as larvas. </li><li> Usando um par de maçante Dumont No. 5 fórceps inverter as larvas de dentro para fora. Inserir uma pinça dentro da cutícula larval todo o caminho até o fim posterior. Aperte as pontas das pinças juntos para agarrar a extremidade posterior da cutícula (Figura 1a) (tente pressionar a cutícula para baixo na superfície Sylgard para tornar mais fácil). Usando o segundo par de fórceps, empurre a cutícula larval dentro para fora. [Passo Crítico: Tente praticar este método algumas vezes antes de tentar a experiência de isolamento de células. Tentar obter as larvas totalmente invertido, para garantir que todos os tecidos moles são expostos à solução para a dissociação fácil.] </li><li> Depois de dissecar as larvas 3-4, transferi-los imediatamente ao fresco, gelada PBS (colocar o tubo no gelo) em um tubo de microcentrífuga 1,6 ml. </li><li> Repita os passos 3,1-3,4 até que todas as larvas necessários são recolhidos (30-40 larvas neste protocolo). [Passo Crítico:. Antecipar 10-20% de perda durante a dissecção e dissociação, e decidir em conformidade] </li></ol> 4. Remoção de vagamente aderente não-específicos de células: (2-3 minutos) [Este passo ajuda a compensação de vagamente aderente não-específica tecidos, tais como corpos gordos e CNS.] <ol><li> Pegue o tubo de microcentrífuga 1,6 ml contendo as cutículas invertida larval e substituir o sobrenadante, com cerca de 700-800 mL de doce gelada PBS. </li><li> Pulso vortex-o tubo de microcentrífuga 5 vezes (3 segundos por pulso) em plena velocidade. </li><li> Desprezar o sobrenadante e substituí-la por cerca de 700-800 mL fresco, gelada PBS. </li><li> Repita os passos 4.2 e 4.3 três vezes. </li><li> Resuspend as cutículas larval em 400 mL de fresco, gelada PBS </li></ol> 5. Dissociar o tecido em uma suspensão única célula: (18-20 minutos) [Passo Crítico: Over-dissociação pode causar a perda do marcador de superfície celular, levando à produção de células pobres e viabilidade celular baixa. O tecido larval pode ser dissociada por qualquer dissociação mecânica (ultra-som, douncing), dissociação enzimática (tripsina, colagenase, etc) ou uma combinação de ambos. Como estes tecidos larval são difíceis de dissociar, descobrimos que uma combinação de ambos dissociação mecânica e enzimática rendeu os melhores resultados.] <ol><li> Adicione 1,5 mL de Liberase 1X Blendzyme 3 (28 unidades nsch W / frasco) para a cutícula larval suspensos em 400 mL de PBS. </li><li> Vortex a solução 2-3 vezes para cada um segundo a configuração máxima (Isto deve remover as células frouxamente aderente da cutícula na solução). </li><li> Incubar a solução à temperatura ambiente (22-25 ° C) por 5 minutos. [Passo Crítico: O tempo de incubação afeta grandemente a eficiência de classificação final, celular. O tempo de incubação recomendado deve ser suficiente para soltar o tecido. Não exceder 15 minutos.] </li><li> Pulso vortex-tubo 20-30 vezes em configurações máximas de 2 segundos por pulso em plena velocidade. Isto deve libera o músculo e outros tecidos para a solução. Inspecionar uma pequena amostra da solução em uma fluorescente estereomicroscópio em cada etapa. (Com a experiência deve ser capaz de determinar o nível de dissociação, observando o tubo de microcentrífuga diretamente sob uma fluorescência habilitado estereomicroscópio) </li><li> Lavar as cutículas larval 2-3 vezes com peixe fresco e gelado PBS e, finalmente, ressuspender-los em 500 mL de doce gelada PBS, contendo BSA 1%. </li><li> Para evitar a cutícula larval adere à superfície de vidro do moedor 2 ml Kontes tecido e um pilão grande folga, revestimento de pré-o moedor de tecido e com um pilão BSA 1% em solução PBS e depois de um breve lavar descartar a solução BSA. Posteriormente, usando um fogo-polido Pasteur pipeta, transferir as cutículas do passo 5.5 para o moedor de tecido revestido BSA. [Passo Critical: Pré-cool moedor do tecido / pilão, colocando-o no gelo por alguns minutos para evitar danos às células / lise]. </li><li> Dounce o tecido com pinceladas lenta e constante, evitando a formação de espuma (aproximadamente 20-30 AVC). [Passo Crítico:. Dounce lenta e progressivamente, caso contrário, as células podem lisar] </li><li> Para avaliar os níveis de células dissociação, limpe a parede externa do moedor de tecido com um tecido Kimwipe limpa, e inspecione-a sob um fluorescentes estereomicroscópio. Os neurônios deveria ter separado da cutícula, e pode ser visto na solução. Se este for encontrado para ser difícil, alternativamente pipeta uma pequena amostra da solução, e observá-la sob um fluorescentes estereomicroscópio. Uma boa indicação de célula de dissociação é a ausência de neurônios a partir da cutícula larval. No entanto, se um ainda observa os neurônios ligados à cutícula, ou observa células incompletamente dissociados, Dounce ainda mais até que as células alcançar uma suspensão única célula. </li><li> Triturar a solução 5 vezes com um fogo-polido pipeta Pasteur reduzido para aproximadamente 50% do diâmetro da ponta standard, seguido por 10 vezes, com um fogo-polido pipeta Pasteur reduzido para aproximadamente 25% do diâmetro da ponta padrão. [Passo Crítico: trituração Forceful pode danificar as células. Monitorar as células entre as etapas, e ajustar o procedimento de acordo]. </li><li> Filtrar a solução através de um filtro de células 30 mm e recolher o filtrado de células em um tubo de microcentrífuga 1,6 ml. A solução resultante deve consistir de uma única célula de suspensão e está agora pronto para separação de células magnéticas. </li></ol> 6. Separação de células magnéticas Bead: (45 - 75 minutos, dependendo do tempo de incubação de anticorpos) <ol><li> Adicionar 15 mL de anticorpo esferas magnéticas revestidas a 500 mL de suspensão de células (passo 5.10). Os restantes anticorpo conjugado esferas magnéticas podem ser armazenados até ser necessário para isolamentos de células subseqüentes. </li><li> Incubar as células com o anticorpo esferas magnéticas revestidas por 30-60 minutos em gelo, com ocasionais hand-mistura. [Passo Crítico: Incubação a uma temperatura mais alta ou mais tempo pode resultar em ligação não específica de anticorpos.] </li><li> Coloque o tubo de microcentrífuga em um campo magnético forte por 2 minutos. Todas as células positivamente selecionado junto com miçangas unbound vai separar para o lado do tubo. </li><li> Pipeta lentamente o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet celular. </li><li> Lave as células 3-4 vezes em fresco, gelada PBS para remover qualquer remanescentes não-específicos de células. </li><li> Ressuspender as células em 30 mL de fresco, gelada PBS. </li><li> Para a pureza e rendimento aproximado de células, pipetas mL 5 da susp celularension na superfície polida de um hemocitômetro e contar todas as células visíveis fluorescente sob a fluorescente estereomicroscópio. Também verificar a quantidade de células não-fluorescentes e todos os sinais de impurezas. Tipicamente, a amostra será altamente enriquecido para as células fluorescentes. </li></ol> 7. Isolamento de RNA Bead Magnética Células Ordenado: (60 - 75 minutos) <ol><li> Após a contagem, agregar as células em um campo magnético, desprezar o sobrenadante e adicionar 20 mL de tampão de extração do RNA ™ PicoPure Isolation Kit (dispositivos Molecular). Dependendo do número de células pode-se necessário acrescentar um maior volume de tampão de extração. </li><li> Vortex do tubo a uma velocidade máxima de permitir a mistura de pellet celular com tampão de extracção. </li><li> Incubar o tubo a 42 ° C por 30 minutos. </li><li> Para assegurar a remoção das esferas magnéticas antes da purificação da coluna do RNA (veja o passo 7.5), o tubo é centrifugado brevemente em 2000 (x) g por 2 minutos para agregar as esferas magnéticas. O tubo é então colocado em um campo magnético forte para manter o sedimento, eo sobrenadante é transferido para um tubo de microcentrífuga novo. </li><li> Extrair e purificar o RNA coluna de acordo com as instruções do fabricante PicoPure RNA kit de extração. Tratamento DNAse é opcional, e pode ser realizada na coluna durante a purificação RNA de acordo com a exigência de análise. Finalmente, eluir o RNA ligado total em um volume pequeno (11-30 mL) de tampão de eluição e armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para uso. Se desejar uma alíquota de 1 ml pode ser usado para avaliar a qualidade do RNA total em um Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.). </li></ol> Resultados representativos: Classificação grânulo magnético foi usado para isolar Drosophila da neurônios (Figura 1). O RNA purificado destas neurônios isolados da (Figura 2a) foi encontrado para ser de excelente qualidade, como indicado pela presença de 5.8S afiada, 18S e 28S ribossomal RNA picos quando analisado em um Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) ( Figura 2b). Começando com 30-40 larvas de terceiro estádio fomos capazes de isolar em média 300-500 neurônios classe IV da usando o driver ppk-GAL4 e 1500-2000 neurônios da (Classe I, II, III e IV), utilizando o pan- da neurônio-específica GAL4 21-7 driver. Para avaliar o enriquecimento neuronal específico de nossas células isoladas foi realizada quantitativa transcrição reversa PCR (qRT-PCR) usando dois genes específicos neuronal marcadores (elav e futsch). Essas análises revelaram enriquecimento vezes significativo de genes tanto marcador indicando um enriquecimento altamente específico para neurônios da em relação ao fluxo através da utilização de nosso protocolo (Figura 3). Finalmente, o RNA isolado de ambos os pan-da neurônios e os neurônios de classe IV da era usado para realizar perfil de expressão transcricional em Drosophila melanogaster microarrays Agilent todo o genoma oligo (4 x 44K) (Figura 4). Estas análises identificaram numerosas reguladores previamente implicado da morfogênese da dendrito do neurônio, além de um amplo espectro de moléculas já descaracterizados e vias de sinalização de transdução de putativos que desempenham importantes papéis funcionais no desenvolvimento da neurônio. Estudos destinados a avaliar o papel potencial (s) destas moléculas anteriormente descaracterizados na mediação da desenvolvimento dos neurônios, e morfogênese especificamente dendrite, estão atualmente em andamento. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure1tmb.jpg" border="0" /> Figura 1:. Esquemática da classificação grânulo magnético dos neurônios da Drosophila (a) Idade combinado larvas de terceiro estádio que ostenta a da neurônio-específica GAL4, UAS-mCD8-GFP repórter transgene são dissecados, invertendo a cutícula larval de dentro para fora, para expor o PNS à dissociação buffer e conservado em gelo frio PBS. (b) dissociação enzimática é realizada através da adição Liberase Blendzyme 3 para a solução contendo cutícula larval. (c) Os tecidos larval são mais dissociadas por uma combinação de trituração vórtex e douncing para retirar não-tecidos especificamente rotulados como fat-corpos intestino, e do SNC. (d, e) As células são, então, filtrada usando um filtro de células 30 mM. A solução contém uma suspensão de células individuais de diferentes tipos celulares, incluindo epitélio musculares e neurônios. (F) Anti-rato CD8a anticorpos revestido Dynabeads M-280 são adicionados à suspensão celular, e incubado em gelo por 30-60 minutos. ( g) As esferas magnéticas se liga aos neurônios da que estão expressando um rato CD8 tag proteína de fusão GFP. (h, i) O grânulo magnético revestido células são separadas por colocar a solução em um forte campo magnético. O sobrenadante é descartado, e as células são lavadas três vezes para remover qualquer resíduo não-específicos de células, resultando em (j) highly purificada populações de neurônios da. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure1.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure2tmb.jpg" border="0" /> Figura 2: (a) Representante da imagem positivamente selecionado, GFP fluorescente neurônios classe IV da célula isolada por dissociação e classificação grânulo magnético. A população de neurônios, resultando estava determinado a ser altamente enriquecido para os neurônios de classe IV da com pouca ou nenhuma célula de impurezas contaminantes. (B) Um Agilent 2100 Bioanalyzer electroferograma (Agilent Technologies, Inc.) de RNA total isolado de grânulo magnético neurônios classificadas da , mostrando uma excelente qualidade de RNA total, como indicado pela presença de 5.8S, 18S, 28S e rRNAs. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure2.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 2. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure3.jpg" border="0" /> Figura 3: qRT-PCR análise de expressão gênica em marcador neuronal isolada da neurônios (GAL421-7, UAS-mCD8-GFP) eo fluxo através de fração foi realizado em triplicata. Os níveis de expressão dos dois genes neuronal específica marcador (elav e futsch) foram avaliados por qRT-PCR. Valores obtidos a partir dessas análises foram normalizados para o controle endógeno (rp49), e os níveis relativos aos observados no fluxo através fração foram calculados usando o método ΔΔCτ 6. Ambos elav e futsch foram significativamente enriquecido no isolado da população de neurônios, em comparação com o fluxo através de fração. <img src="/files/ftp_upload/1599/1599figure4tmb.jpg" border="0" /> Figura 4: Representante de classe IV da Cy3 neurônio-específica rotulados microarray arquivo de imagem. Mostrada aqui é um Agilent Drosophila melanogaster todo o genoma oligo microarray (4 x 44K) hibridizados com Cy3-labeld RNA total isolado de neurônios de classe IV da classificação purificado por grânulo magnético. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1599/1599figure4.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 4.

<ol>
	<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li><li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system:+links+with+peripheral+dendrite+morphology.">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li><li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae.">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+methods.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li></ol>

O protocolo aqui apresentado é otimizado para o isolamento e purificação de neurônios periféricos que aderem firmemente à superfície interna do estádio terceiro Drosophila cutícula larval usando uma estratégia de triagem magnética talão celular. Embora tenhamos utilizado este protocolo especificamente para isolar neurônios da Drosophila, aplicações deste protocolo para o isolamento de outros tipos de células que se aderem à cutícula larval ou na fase de pupa de desenvolvimento (por exemplo, epitélios,...

Equipamento <ul><li> (10) ímãs de neodímio bloco (K &amp; J Magnetics, Inc., Cat. # B444B), alternativamente DynaMag ™ -2 (Invitrogen, Cat. # 123-21D) podem ser usados. </li><li> Kontes Grinder tecido de vidro, 2 ml de capacidade de trabalho, com pilão grande folga (Cat. # 885300-0002) </li><li> Filtros de celular, por exemplo, MACS Pré-Separação Filter (Miltenyi Biotec, Cat. # 130-041-407) </li><li> 35 milímetros petri pratos revestido com Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. # 3097358-1004) </li><li> Ferramentas de dissecação: dois pares de fórceps Dumont n º 5 (Ferramentas Ciência Fine, Cat # 11251-20). </li><li> Vannas primavera micro-tesoura de dissecção (Ferramentas Ciência Fine, Cat. # 15000-08) </li><li> Pipetas (P-1000, P-100, P-10) com pontas </li><li> Hemocitômetro padrão para contar as células e pureza estimativa </li><li> Pipetas Pasteur com pontas de fogo polido de diâmetro padrão, diminuiu para ~ 50% do diâmetro normal e reduzido para ~ 25% do diâmetro padrão para trituração </li><li> Tabela centrífuga micro-top (1-16,000 (x) g) </li><li> Vórtice </li><li> Fluorescentes estereomicroscópio (a MZ16FA Leica foi usado neste protocolo) </li></ul>

isolation and purification of drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting

O<em&gt; Drosophila</em&gt; Sistema nervoso periférico (PNS) é um poderoso modelo para investigar os processos complexos de desenvolvimento neuronal e morfogênese dendrite a nível funcional e molecular. Para auxiliar nestas análises, temos desenvolvido uma estratégia para o isolamento de uma subclasse de neurônios chamado PNS arborização dendrítica (da) neurônios que têm sido amplamente utilizados para estudar a morfogênese dendrite<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Esses neurônios são muito difíceis de isolar como uma população pura, em parte devido à sua ocorrência extremamente baixa e sua difícil de alcançar localização abaixo da cutícula quitinosa resistente larval. Nosso método recém-desenvolvido supera estes desafios, e é baseado em uma célula de enriquecimento rápido e específico utilizando anticorpos revestido esferas magnéticas. Para os nossos estudos de triagem magnética talão, temos utilizado pareados por idade larvas de terceiro estádio expressar um rato CD8 proteína de fusão com a tag GFP (<em&gt; UAS-mCD8-GFP</em&gt;)<sup&gt; 3</sup&gt; Sob o controle tanto da arborização dendrítica classe IV (da) neurônio-específica<em&gt; Pickpocket (PPK)-GAL4</em&gt; Driver<sup&gt; 4</sup&gt; Ou o controle da pan-da GAL4 neurônio-específica<sup&gt; 21-7</sup&gt; Driver<sup&gt; 5</sup&gt;. Embora este protocolo foi optimizado para isolar PNS células que estão ligados à parede interna da cutícula larval, variando alguns parâmetros, o mesmo protocolo pode ser usado para isolar muitos tipos de células diferentes ligados à cutícula nas fases larval e pupal de desenvolvimento (por exemplo, epitélios, músculo, oenocytes etc), ou outros tipos de células de órgãos larval, dependendo do padrão de expressão GAL4 driver específico. O RNA isolada por este método é de alta qualidade e pode ser facilmente usado para jusante análises genômicas, tais como gene microarray estudos de perfil de expressão. Esta abordagem oferece uma nova e poderosa ferramenta para realizar estudos sobre isolado<em&gt; Drosophila</em&gt; Dendríticas arborização (da) neurônios proporcionando conhecimentos novos sobre os mecanismos moleculares subjacentes à morfogênese dendrite.

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Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

Neste vídeo-artigo apresentamos um método para o isolamento e purificação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurônios periféricos usando um jejum magnética estratégia de triagem talão assistida celular. RNA obtido a partir de células isoladas podem ser facilmente usados ​​para aplicações a jusante, incluindo análises microarray.

Isolamento e purificação de Drosophila Neurônios periféricos por classificação Bead Magnética

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

13.3K visualizações.  George Mason University. Neste vídeo-artigo apresentamos um método para o isolamento e purificação de Drosophila Neurônios periféricos usando um jejum magnética estratégia de triagem talão assistida celular. RNA obtido a partir de células isoladas podem ser facilmente usados ​​para aplicações a jusante, incluindo análises microarray.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biologia

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento de Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolamento e Purificação de cinesina partir Drosophila Os embriões

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolamento de cromatina por purificação de RNA (CHIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their prominent presence is often associated with poor prognosis1,2. CAFs are an activated subpopulation of stromal fibroblasts, many of which express the myofibroblast marker &alpha;-SMA3. CAFs originate from local tissue fibroblasts as well as from bone marrow-derived cells recruited into the developing tumor and adopt a CAF phenotype under the influence of the tumor microenvironment4. CAFs were shown to facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes tumor cell proliferation, angiogenesis, and invasion5-8. We demonstrated that CAFs enhance tumor growth by mediating tumor-promoting inflammation, starting at the earliest pre-neoplastic stages9. Despite increasing evidence of the key role CAFs play in facilitating tumor growth, studying CAFs has been an on-going challenge due to the lack of CAF-specific markers and the vast heterogeneity of these cells, with many subtypes co-existing in the tumor microenvironment10. Moreover, studying fibroblasts in vitro is hindered by the fact that their gene expression profile is often altered in tissue culture11,12 . To address this problem and to allow unbiased gene expression profiling of fibroblasts from fresh mouse and human tissues, we developed a method based on previous protocols for Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)13,14. Our approach relies on utilizing PDGFR&alpha; as a surface marker to isolate fibroblasts from fresh mouse and human tissue. PDGFR&alpha; is abundantly expressed by both normal fibroblasts and CAFs9,15 . This method allows isolation of pure populations of normal fibroblasts and CAFs, including, but not restricted to &alpha;-SMA+ activated myofibroblasts. Isolated fibroblasts can then be used for characterization and comparison of the evolution of gene expression that occurs in CAFs during tumorigenesis. Indeed, we and others reported expression profiling of fibroblasts isolated by cell sorting16. This protocol was successfully performed to isolate and profile highly enriched populations of fibroblasts from skin, mammary, pancreas and lung tissues. Moreover, our method also allows culturing of sorted cells, in order to perform functional experiments and to avoid contamination by tumor cells, which is often a big obstacle when trying to culture CAFs.

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Cancer Associated Fibroblasts (CAFs) facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes proliferation, angiogenesis, and inflammation. Here we describe a method to isolate pure populations of normal fibroblasts and CAFs from fresh mouse and human tissues by cell sorting, using PDGFR&#x03B1; as a surface marker.

Isolamento de fibroblastos normais e associados ao câncer de tecidos frescos, classificando células activadas por fluorescência (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Purificação de Transcrições e metabolitos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Cabeças

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identificando interacção proteína-proteína em<em&gt; Drosophila</em&gt; Chefes Adulto por Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Rápido isolamento e purificação de mitocôndrias para o transplante pela dissociação do tecido e Filtração Diferencial

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Isolamento e caracterização de microvesículas a partir de sangue periférico

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

Classificação celular ativada pela fluorescência para o isolamento de populações celulares escleracianas

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...