Agradecimentos especiais a Kris Ngai e Jason Del Rio, pelo apoio e ajuda neste projeto. Este trabalho foi apoiado por RO1 concessão GM070676 para SPG.

Cepas de moscas pode ser comprado e amplificado no laboratório. Dependendo da quantidade de frascos de cultura de Drosophila recebidos, uma necessidade de frequência &#39;flip&#39; os frascos de cultura, uma vez que os frascos atingiu a capacidade máxima. A amplificação continua até cerca de 50 frascos de cultura de Drosophila estão cheios. Um, em seguida, faz &quot;voar copos&quot; com 100 ml tricorn copos (Fly tomada copo é discutida na próxima seção). Após 24 horas, utilizar embriões a partir destes copos para semear novos frascos de cultura de Drosophila com alimentos mosca afixada na parte inferior. À temperatura ambiente, o tempo de crescimento para os embriões de Drosophila a partir de embriões completos durante a noite para moscas crescidas são cerca de 8,5 dias. Embriões semeados eclodem após 12-15 horas para o estágio de larva em primeiro lugar. As larvas crescer durante cerca de 4 dias a muda duas vezes para a fase de larvas de segundo e terceiro, aos 24 e 48 horas após a eclosão. As larvas então encapsular em pupariums e se submeter a uma metamorfose 4 dias até surgir a partir de tcasos herdeiro pupa 1. Permitir uma maior crescimento durante cerca de 2-3 dias nos frascos de cultura de Drosophila para aumentar a quantidade de moscas em cada um. Quando 400 frascos são preenchidos, haverá uma quantidade suficiente de moscas por cinqüenta copos de ovos poedeiras (Cerca de 1.000 moscas fêmeas por xícara). Moscas precisam de tempo para ajustar ao seu novo ambiente. Geralmente, leva cerca de dois dias para eles para estar pronto para a coleta, depois de ser transferido para os copos. Substituição de placas de ágar diária vai manter os copos limpos da mosca, que permitem que as moscas a viver mais tempo. (Para uma maior compreensão de Drosophila cuidado e amplificação, consulte a Drosophila DB Roberts: Uma Abordagem Prática 2). Uma boa fonte para obter grandes quantidades de embriões de Drosophila são gaiolas população 3, que são comercialmente disponíveis. A montagem e manutenção de gaiolas população pode ser visto no capítulo 5 e 7 do livro de Drosophila melanogaster: PUsos ractical na célula e 4 de Biologia Molecular. No entanto, as gaiolas da população são caros e são difíceis de manter. Uma vez que as gaiolas população pode conter uma quantidade abundante de moscas, o uso de dióxido de carbono é necessário para a transferência e de alimentação moscas. Como indicado antes, o dióxido de carbono diminui a saúde das moscas, fazendo com que eles não estabelecer também. Em pequena escala, copos de 100 ml tricorn pode ser usado. Com cinquenta 100 ml provetas, 9 gramas de embriões dechorionated pode ser alcançada. A fim remover as moscas mortas, pasta de levedura utilizada e outras impurezas que criamos um apanhador de peneira dupla camada com diferentes tamanhos de malha. Uma peneira armadilhas materiais indesejados, como moscas mortas enquanto permite a passagem de embriões (350 tamanho dos poros micron). A segunda parte contém uma malha (120 tamanho de poro microns), que se destina a pegar embriões de Drosophila e outras impurezas passarão através da malha. 1. Fly Preparação Cup e colheita de embriões <ol><li> Sacudiras moscas amplificadas a partir de frascos múltiplos em um frasco de plástico vazio, até que a quantidade de moscas ter atingido uma polegada de altura do frasco. Em seguida, transfira essas moscas em um ovo de 100 ml coleção xícara (Tricon copo com nylon de malha janelas). Continue a tocar o copo sobre uma superfície dura para impedir a fuga de moscas durante a transferência de moscas. Cubra copo com agar de levedura de pasta placa contendo e permitir 24-48 horas de tempo de estabilização. </li><li> Collect placas de agar durante a noite a partir de cinquenta copos mosca e lavar os conteúdos das placas para o apanhador crivo usando um pincel de tinta limpo e água corrente. Carne dos embriões na peneira com água em abundância até que todo o fermento pasta é lavada. </li><li> Dechorionate os embriões limpos por imersão em água sanitária 50% durante 3 min. </li><li> Enxágüe com água destilada extensivamente até embriões soltos o odor lixívia. Em seguida, seque a malha com embriões, colocando-o em tempos de toalha ac vezes múltiplos. Transferir os embriões para um frasco limpo e registar o peso. &lt;/ Li&gt; </ol> 2. Homogeneização embrião e Esclarecimento <ol><li> Coloque embriões dechorionated em Dounce homogeneizador com 1,5 x volume de tampão gelado de extracção. </li><li> Faça 5 cursos com o pilão solto. Alíquota o homogeneizado em tubos de centrífuga limpo. Centrifugar a 15.000 g durante 40 min. a 4 ° C. </li><li> Cuidadosamente recolher o líquido claro sobrenadante sem a camada lipídica superior branco ou a pelete inferior. </li><li> Transferir o sobrenadante para limpar tubos de centrífuga e centrifugar a 50.000 g durante 30 min. a 4 ° C </li><li> Resultante sobrenadante de alta velocidade recolhido como explicado acima pode ser utilizada imediatamente ou podem ser encaixe congeladas e armazenadas a -80 ° C durante meses. </li></ol> 3. A polimerização dos microtúbulos e cinesina Binding <ol><li> Descongelar o sobrenadante de alta velocidade congelado até à temperatura ambiente. Para polimerizar microtúbulos, adicionar GTP (0,3 mM) e taxol (20 uM) e agitar suavemente à temperatura ambiente durante 20 min emum agitador rotativo. </li><li> Para ligar cinesina, adicionar 2,5 mM ATP nonhydrolyzable analógico imidodiphosphate 5&#39;-ciclase (AMPPNP), seguido por uma agitação de 10 min à temperatura ambiente em um agitador rotativo. </li></ol> 4. Sedimentação diferencial de microtúbulos e cinesina <ol><li> Sedimento através de uma almofada de igual volume de sacarose (sacarose a 20% e 10 uM de taxol em tampão de extracção) por centrifugação a 23.000 g (sw41ti rotor, TLS-55) durante 30 min. a 4 ° C. </li><li> Lavar pelete por ressuspensão em 10% do volume original em homogenato de tampão de extracção contendo 10 mM de taxol e 75 mM de NaCl. </li><li> Repita a sedimentação com uma outra almofada igual volume de sacarose como no passo 4.1. </li><li> Re-suspende pelete de lavagem sal em tampão de extracção de 5% com 20 mM de taxol, 75 mM de NaCl, 10 mM de MgSO4, e 10 mM de ATP. </li><li> Sedimento no 120.000 g (sw41ti rotor: 31.000 rpm, TLS-55: 42.000 rpm) durante 20 min a 4 ° C. Recolher o sobrenadante (cinesinafração). </li><li> Realizar uma filtração centrífuga a 14.000 g durante 15 min a 4 ° C. Recuperar amostra concentrada e repetir filtração com um filtro novo como acima durante 30 minutos e recolher a amostra concentrada. </li><li> Executar um ensaio de proteína para determinar a concentração. Resumidamente, variando as concentrações de uma proteína conhecida (albumina de soro bovino; BSA) foi misturada com um volume conhecido de reagente de Bradford e medido a densidade óptica no comprimento de onda 595nm. Em seguida, uma densidade óptica versus curva padrão de concentração foi estabelecida para calcular a concentração desconhecida de fracção purificada cinesina usando a densidade óptica da amostra medida sob condições similares às que as amostras de BSA padrão. A electroforese em gel, bem como western blotting foi também realizada utilizando uma quantidade conhecida do cinesina purificada. </li><li> Fracção alíquota cinesina em pequenos volumes de concentração desejada e congelamento em azoto líquido encaixe para armazenar a -80 ° C. </li></ol> Full-length cinesina funcional foi purificado a partir de embriões de Drosophila. A Figura 1 mostra o gel corado com prata mostra as diferentes fracções durante a purificação. Pista 1 é uma amostra do sobrenadante de alta velocidade após clarificação (passo 2.5), a pista 2 é uma amostra do sedimento após clarificação, pista 3 é uma amostra do sobrenadante após a sedimentação primeiro com almofada de sacarose (passo 4.1), pista 4 é uma amostra do sedimento após a sedimentação em primeiro lugar, pista 5 é uma amostra do sobrenadante após a sedimentação segundo (passo 4.3), a pista 6 é uma amostra do sedimento após a sedimentação segundo, pista 7 é uma amostra do sedimento de a sedimentação final (passo 4.5), pista 8 é a amostra cinesina purificado, pista 9 é a amostra cinesina filtrada, e pista 10 é o marcador. A banda concentrado na pista 8 e 9 em cerca de 115 kD é cinesina de cadeia pesada 1, o que é consistente com Figure 1, pista 8 do papel Saxton publicado em 1988 5. Figura 2 representa o c western blot da fracção purificada cinesina detectado utilizando o anticorpo de cadeia pesada cinesina. O anticorpo AKINO1-A não significativamente reagem de forma cruzada com outros membros da família cinesina 6. Note-se que apesar de o protocolo resulta em uma boa fonte de cinesina funcional, enquanto que a fracção é enriquecido para cinesina-1, existem contaminantes susceptíveis, incluindo potencialmente kinesinas outros e proteínas motoras outros. Nós removido de uma variedade de contaminantes menores por filtração. No que diz respeito a remoção outros motores que não pode ser feito por tamanho por si só, a purificação é semelhante ao que foi feito por outros para estudar cinesina 7, e acreditamos que a maioria do motor activa é cinesina-1, mas a purificação mais sofisticado permitiria remoção de contaminantes de motor potenciais, como foi feito por Cole et al 8 e Saxton et al. 9 </p&gt; A processabilidade de cinesina foi avaliada por ensaio in vitro única molécula de microtúbulos de ligação, como descrito em mais detalhe no livro por Scholey intitulado &quot;Ensaio Motilidade para Motor Proteínas&quot; 10. Resumidamente, esferas de poliestireno com um único motor activa foram postos em contacto com o microtúbulo, na presença de saturar (1 mm) de ATP. O motor ligado ao microtúbulo, e começou a andar de distância do centro da armadilha laser. Com um deslocamento de pré-definido do grânulo a partir do centro armadilha (100 nm) a potência do feixe de laser foi automaticamente desligado, permitindo que o motor para caminhar ao longo do MT sem carga. O filme mostra um diâmetro 500 nm talão com kinesin único andando MT. O comprimento do ecrã de vídeo corresponde a 20 microns. Figura 3 representa a distribuição medida de run-comprimentos individuais para todo o comprimento moléculas de Drosophila cinesina, purificada de acordo com o protocolo apresentado aqui. O exponentiai apto para a distribuição fornece o RunLength média de cinesina único 1,55 ± 0,1 mM e 1,28 ± 0,12 mM para a amostra filtrados e não filtrados, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> A Figura 1 Prata gel corado das fracções purificadas:. Amostras de cada fracção foram executados num gel de 10%. 10 ug de proteína foi carregada em cada pista. Pista 1 é uma amostra do sobrenadante de alta velocidade após clarificação (passo 2.5), a pista 2 é uma amostra do sedimento após clarificação, pista 3 é uma amostra do sobrenadante após a sedimentação primeiro com almofada de sacarose (passo 4.1), pista 4 é uma amostra do sedimento após a sedimentação em primeiro lugar, pista 5 é uma amostra do sobrenadante após a sedimentação segundo (passo 4.3), a pista 6 é uma amostra do sedimento após a sedimentação segundo, pista 7 é uma amostra do sedimento de a sedimentação final (passo 4.5), pista 8 é a cinesina purificadoamostra, pista 9 é a cinesina filtrada usando um 100 kD de corte Amicon ultra-filtro de 0,5 ml centrífuga (Millipore, EUA). As setas azuis indicam as proteínas cujos valores foram reduzidos ea seta vermelha indica a concentração de cinesina devido à etapa de filtração centrífuga utilizada neste protocolo. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig2.jpg" alt="A Figura 2" /> . Figura 2 purificada fracção KHC blotted contra o anti-anticorpo cinesina: purificada amostra cinesina foi submetido à eletroforese em gel e apagados (em membrana de nitrocelulose) contra o anticorpo primário AKINO1-A (1:1.000 em TBST) durante 1 hora à temperatura ambiente seguido de incubação em Donkey-anticorpo anti-coelho (1:10.000 em TBST) durante uma hora à temperatura ambiente. Um ECL kit (quimioluminescente) foi utilizado para detectar o sinal de cinesina mostrado acima. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. </strong&gt; RunLength e Velocidade de única kinesin comprimento Drosophila total: (A) e (B) RunLength e Velocidade de amostra kinesin filtrada. (C) e (D) RunLength e velocidade de amostra cinesina não filtrada. Figura 4. Vídeo da motilidade cinesina. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3501/3501movie4.avi" target="_blank">Clique aqui para ver o vídeo</a> .

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	<li>Ashburner, M., Thompson, J. N., Ashburner, M., Wright, T. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+culture+of+Drosophila+2A.">The laboratory culture of Drosophila 2A.</a> The genetics and biology of Drosophila. , 1-81 (1978).</li><li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Practical Approach. , (1998).</li><li>Kunert, N., Brehm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+Drosophila+Embryosand+Chromatographic+Purification+of+Native+Protein+Complexes.">Mass production of Drosophila Embryosand Chromatographic Purification of Native Protein Complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 359 (2008).</li><li>Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A., Wilson, L., Matsudaira, P. T., Eds, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+Uses+in+Cell+and+Molecular+Biology.">Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, (1994).</li><li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+kinesin:+Characterization+of+microtubule+motility+and+ATPase.">Drosophila kinesin: Characterization of microtubule motility and ATPase.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 85, 1109 (1988).</li><li>Shubeita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets.">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1098 (2008).</li><li>Svoboda, K., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+Velocity+Measured+for+Single+Kinesin+Molecules.">Force and Velocity Measured for Single Kinesin Molecules.</a> Cell. 77, 773 (1994).</li><li>Cole, D. G., Saxton, W. M., Sheehan, K. B., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+"Slow"+Homotetrameric+Kinesin-related+Motor+Protein+Purified+from+Drosophila+embryos.">A "Slow" Homotetrameric Kinesin-related Motor Protein Purified from Drosophila embryos.</a> J. Biol. Chem. 269, 22917-22917 (1994).</li><li>Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Analysis+of+Microtuble+Motor+Proteins.">Isolation and Analysis of Microtuble Motor Proteins.</a> Drosophila Melanogaster. Bloomington: Academic. 44, 279 (1994).</li><li>Scholey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+Assay+for+Motor+Proteins.">Motility Assay for Motor Proteins.</a> Methods in Cell Biology. 39, 138 (1993).</li><li>Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+kinesin+from+bovine+brain+and+assay+of+microtubule-stimulated+ATPase+activity.">Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Enzymology. 196, 157 (1991).</li><li>Aizawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+Family+in+Murine+Nerwous+System.">Kinesin Family in Murine Nerwous System.</a> The Journal of Cell Biology. 119, 1287-1287 (1992).</li><li>Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytoplasmic+dynein+tail+mutation+impairs+motor+processivity.">A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity.</a> Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Cérebro de bovino é o material mais amplamente utilizado de partida 11 para purificar full-length cinesina, embora cérebro de murídeo tem sido utilizado como bem 12. Uma grande desvantagem da utilização de cérebro de bovino como fonte de cinesina é a disponibilidade de material de partida fresco: matadouros são tipicamente inacessível, eo cérebro deve ser extremamente fresco, a fim de obter cinesina activo. Além disso, apenas os cérebros de vacas jovens são eficazes. Finalmente, a man...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente ou material </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Agar (granulado) </td><td> Pescador </td><td> 1423-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrose (D-glucose) anidro </td><td> Pescador </td><td> D16-3 </td><td></td></tr><tr><td> As placas de Petri </td><td> Becton </td><td> 35 1007 </td><td> Estilo 60x15mm (Poliéster) 20/bag </td></tr><tr><td> Drosophila Cultura frascos </td><td> UCI </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Copo Tricorn </td><td> Econo Lab Inc. </td><td> B700-100 </td><td> Volume: 100 ml, Tamanho: 58x72mm </td></tr><tr><td> Levedura </td><td> Red Star </td><td> 2751 </td><td></td></tr><tr><td> Malha de nylon </td><td> Genesse Científico </td><td> 57-102 </td><td> 120 micron tamanho de poro </td></tr><tr><td> Malha de nylon </td><td> Peças pequenas </td><td> 06-350/35 </td><td></td></tr><tr><td> Pipes </td><td> Sigma </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> Pipes </td><td> Sigma </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescador </td><td> 56-81-5 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> 67-42-5 </td><td></td></tr><tr><td> MgS0 4 (anidro) </td><td> Pescador </td><td> 7487-88-9 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Sigma </td><td> 329-98-6 </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=103476-89-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">103476-89-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> Aprotonin </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=9087-70-1&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">9087-70-1</a> </td><td></td></tr><tr><td> TAME </td><td> Sigma </td><td> 178403-8 </td><td></td></tr><tr><td> STI </td><td> Calbiochem </td><td> 65635 </td><td></td></tr><tr><td> GTP </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=36051-31-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">36051-31-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> Taxol </td><td> Sigma </td><td> 33069-62-4 </td><td></td></tr><tr><td> ATP analógico 5&#39;-ciclase imidodiphosphate </td><td> Sigma </td><td> 3605-31-7 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7647-14-5 </td><td></td></tr><tr><td> ATP </td><td> Sigma </td><td> 74804-12-9 </td><td></td></tr><tr><td> Filtros Amicon ultracentrífugo: 0,5 mL, 100kD cortados, 8 embalagens </td><td> Millipore </td><td> UFC510008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and purification of kinesin from drosophila embryos

Proteínas motoras mover cargas ao longo dos microtúbulos, e transportá-los às especificidades sub-celulares locais. Como o transporte alteradas é sugerido para subjacentes uma variedade de doenças neurodegenerativas, compreendendo microtúbulo base de transporte do motor e da sua regulação, provavelmente, em última análise, levar a abordagens terapêuticas melhoradas. Cinesina-1 é uma proteína do motor eucariótica que se move numa direcção anterógrada (plus-fim) ao longo de microtúbulos (MTS), alimentado por hidrólise de ATP. Relatamos aqui um protocolo de purificação para isolar detalhada cinesina comprimento activo total a partir de embriões de Drosophila, permitindo assim que a combinação de Drosophila genética com molécula única estudos biofísicos. Começando com cerca de 50 copos de poedeiras, com cerca de 1000 mulheres por xícara, foram realizadas coletas durante a noite. Isto forneceu cerca de 10 ml de embriões embalados. Os embriões foram lixívia dechorionated (rendendo aproximadamente 9 gramas de embriões), e, em seguida, homogeneizada. Afperturbação ter, o homogeneizado foi clarificada usando uma velocidade de centrifugação de baixa seguido por uma centrifugação de alta velocidade. O sobrenadante clarificado foi tratada com GTP e taxol para polimerizar MTs. Cinesina foi imobilizada em polimerizada MTs adicionando o análogo de ATP, 5&#39;-ciclase imidodiphosphate à temperatura ambiente. Depois de cinesina de ligação, os microtúbulos foram sedimentadas por meio de centrifugação a alta velocidade através de uma almofada de sacarose. O sedimento de microtúbulos foi então re-suspenso, e este processo foi repetido. Finalmente, o ATP foi adicionado para libertar o cinesina a partir do MTs. Centrifugação a alta velocidade, em seguida, centrifugadas a MTS, deixando a cinesina no sobrenadante. Este cinesina foi submetido a uma filtração centrífuga usando um corte 100 KD fora do filtro para a purificação adicional, aliquotadas, encaixe congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C. Electroforese em gel SDS e Western blotting foi realizada utilizando a amostra purificada. A actividade motora das amostras purificadas antes e após o passo de filtração final centrífugafoi avaliada usando um ensaio in vitro única molécula de microtúbulos. As fracções cinesina antes e depois da filtração centrífuga mostrou processabilidade como previamente relatados na literatura. Outros experimentos estão em andamento para avaliar a interação entre cinesina e outras proteínas de transporte relacionados.

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Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Este é um protocolo para isolar cinesina comprimento ativo total de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões de molécula única estudos biofísicos. Nós mostramos como coletar embriões, faça o lisado embrião, e depois polimerizar microtúbulos (MTs). Cinesina é purificado por imobilizando-a sobre o MTS, fiação para baixo os complexos cinesina MT-e, em seguida libertando o cinesina a partir do MTs via adição de ATP.

Isolamento e Purificação de cinesina partir Drosophila Os embriões

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

isolation-and-purification-of-kinesin-from-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

12.1K visualizações.  University of California, Irvine. Este é um protocolo para isolar cinesina comprimento ativo total de Drosophila Embriões de molécula única estudos biofísicos. Nós mostramos como coletar embriões, faça o lisado embrião, e depois polimerizar microtúbulos (MTs). Cinesina é purificado por imobilizando-a sobre o MTS, fiação para baixo os complexos cinesina MT-e, em seguida libertando o cinesina a partir do MTs via adição de ATP.

Vídeo: Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Preparação de culturas de neurônios a partir de embriões Midgastrula Stage Drosophila

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Biologia

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolamento de células T CD4 + a partir dos nós linfáticos rato Usando Miltenyi Purificação MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolamento e purificação de Drosophila Neurônios periféricos por classificação Bead Magnética

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In vivo Centrifugação de Embriões Drosophila

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

Imagem vertical de Drosophila Os embriões

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Culturas de células primárias de Drosophila Os embriões Gástrula

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Purificação de Transcrições e metabolitos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Cabeças

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Isolamento eficiente e rápida de embriões em início de carreira a partir de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sementes

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

TRAP-rc, Traduzindo Ribossomo Affinity Purificação de populações de células raras<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...