Agradecemos Janice Fischer para fornecer o plasmídeo UAS-EGFP :: MSP-300 KASH. O anticorpo mAB24B10 foi obtido a partir do Desenvolvimento Estudos Hybridoma Banco desenvolvido sob os auspícios do NICHD e mantido pela Universidade de Iowa, Departamento de Biologia. O estoque de repo-GAL4 (BL7415) foi obtido a partir do Bloomington Stock Center na Universidade de Indiana. O apoio da American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG # 58-006-53) para a Universidade Purdue Centro para Pesquisa do Câncer é reconhecida com gratidão. Jingqun Ma é apoiado por uma Pesquisa Agrícola em Purdue Estágios em Alimentação e Agricultura da Universidade de Purdue.

1. Geração e Caracterização de EGFP :: KASH Drosophila <ol><li> Cruz Gal4 motorista voa para UAS-EGFP :: MSP-300 KASH voa. Alternativamente, moscas recombinantes que transportam tanto o condutor de Gal4 e do transgene UAS-EGFP :: MSP-300 KASH pode ser gerada utilizando técnicas genéticas convencionais. Esta segunda abordagem é vantajoso se forem necessárias grandes quantidades de progenitura. </li><li> Caracterizar a expressão do marcador EGFP :: KASH usando técnicas de microscopia padrão. Nota: expressão EGFP pode ser observada por técnicas de microscopia de padrão em dissecadas, fixas tecidos de Drosophila, ou em conjunto larvas, e não requer a utilização de um anticorpo. <ol><li> Determinar o padrão de expressão de EGFP :: KASH marcador em todo o organismo sob um microscópio de fluorescência de dissecação (ver Materiais PDF). Nota: Muitos controladores de Gal4, incluindo o controlador de repo-GAL4 mostrado na Figura 1, n exibemonspecific padrões de expressão em outros tecidos, tais como larvas da glândula salivar (ver Resultados). </li><li> Analisar o padrão de expressão de EGFP :: KASH no tecido dissecado de interesse através de microscopia confocal. <ol><li> Fixar o tecido de interesse, utilizando formaldeído numa concentração final de 4%, e ADN de mancha utilizando DAPI, a uma concentração final de 0,1 ug / ml para visualizar a localização da EGFP :: KASH marcação em relação ao ADN. </li><li> Aquisição de imagens utilizando uma objectiva de 40x / 1,30 óleo de imersão ou uma objectiva 20X / 0,75 imersão de óleo, dependendo do tamanho do tecido de interesse. As seguintes condições de excitação / emissão podem ser utilizados para a aquisição de imagens: 408 nm/425-475 nm (DAPI), 488 nm / 525-550 nm (GFP). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Isolar Núcleos de Drosophila larval Tecidos <ol><li> Preparar equipamentos para a dissecção dos tecidos larval e posterior isolamento núcleos. Note-se quedechorionated embriões inteiros também pode ser utilizado como material de partida, se desejado. Recomenda-se utilizar tecidos de larvas parcialmente dissecados em vez de larvas inteira, se o tipo de células de interesse está presente em um tecido específico, tal como o disco imaginal. Isto reduz a ligação não específica, e também elimina os problemas que podem ser causados ​​pela expressão de alguns condutores Gal4 em células não alvo. <ol><li> Preparar dois pares de pinças cortantes (ver Materiais PDF), um 9-siliconizada bem placa de vidro (ver Materiais PDF) e PBT (1x PBS, pH 7,4, 0,1% de Tween-20). </li><li> Prebind o anticorpo GFP às pérolas magnéticas. Esta etapa deve ser iniciada antes do início da dissecção. Adicionar 10 uL de pérolas magnéticas (Invitrogen, ver Materiais PDF) e 2 ug de anticorpo GFP (Roche, ver Materiais PDF) para 400 ul de tampão de lavagem (1x PBS, pH 7,4, 2,5 mM de MgCl 2) em um tubo de 1,5 ml . A quantidade de pérolas e o anticorpo utilizado pode ser optimizada se necessário, com base na quantidade de alvo na samplo e a afinidade de ligação do anticorpo às pérolas. </li><li> Incubar as pérolas e o anticorpo com rotação durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente,. </li><li> Colocar o tubo de 1,5 ml contendo as contas e do anticorpo no suporte magnético (ver Materiais PDF) e permitem que as esferas se liguem ao magnética para aproximadamente 1-2 min. Retirar o sobrenadante contendo o anticorpo não ligado e tampão de lavagem, utilizando uma pipeta de 1 ml. Os grânulos permanecerá ligada à parede do tubo de 1,5 ml, no lado adjacente ao íman. </li><li> Lave as contas duas vezes com 1 ml de tampão de lavagem de cada vez, conforme descrito no ponto 2.1.4. Remover o tubo de 1,5 ml a partir da cremalheira magnética e inverter momentaneamente para misturar os grânulos e tampão de lavagem, durante cada etapa de lavagem. </li><li> Guarde as contas ligadas a anticorpos em tampão de lavagem até que esteja pronto para continuar com o passo 2.7. As contas não devem ser autorizados a secar em qualquer fase do protocolo. </li></ol></li><li> Dissecar tecidos larvais em PBT e transferir tecidos dissecados paraum poço da 9-bem prato. Normalmente, a dissecção do lobo óptico e olho disco imaginal de 100 larvas de terceiro instar fornece material suficiente para a análise de expressão gênica a jusante após isolamento núcleos. </li><li> Lavar o tecido isolado em tampão de extracção nuclear (10 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 2,5 mM de MgCl 2, 10 mM de KCl) em um tubo de 1,5 ml. Transferir tecidos larvais isoladas para um homogeneizador Dounce de 1 ml (ver Materiais PDF) em gelo que contém 1 ml de tampão de extracção nuclear fresco. Incubar no gelo por 5 min. Não é necessário adicionar os inibidores de protease, se o RNA é para ser extraída a seguir ao isolamento de núcleos. </li><li> Perturbar o tecido por 20 ciclos com o pilão solta e depois incubar a amostra em gelo durante 10 minutos para permitir que as células inchar. Extrair os núcleos das células, utilizando 15 pancadas com o pil apertado. O número de golpes com os pilões soltos e apertados precisa ser otimizado para diferentes tecidos e tipos de células; excesso de homogeneização pode resultar emnúcleos cortados, enquanto homogeneização insuficiente não irá extrair todos os núcleos do tecido. </li><li> Filtrar o homogeneizado, que contém os restos nucleares e celulares, por meio de um 40 um tamanho de poros de filtro (ver Materiais PDF) que foi prerinsed com tampão de homogeneização nuclear. Recolhe-se o homogeneizado filtrado num tubo fresco. </li><li> Coletar amostras de pré-isolamento para posterior análise para determinação do rendimento de núcleos, a integridade núcleos, e para determinar os níveis de transcrição de genes-alvo antes de núcleos isolados. <ol><li> Transferência de 50 ul do homogenato filtrado para um tubo de 1,5 ml fresco utilizando uma pipeta. Esta é a amostra de pré-isolamento. Adicionar 500 mL de reagente Trizol (ver Materiais PDF, CUIDADO), invertido para misturar e armazenar a -20 ° C para posterior isolamento do RNA (passo 3.1). </li><li> Transferir 20 uL de homogeneizado do filtrado para um novo tubo de 1,5 ml. <ol><li> Adicionar DAPI para uma concentração final de 0,1 ug / ml, e incUbate amostra em gelo durante 10 min. </li><li> Transferir núcleos DAPI-manchadas de uma lamela revestido poli-lisina, e coloque sobre uma lâmina de microscópio. Selar a lamela usando claro unha polonês. </li><li> Verifique a integridade núcleos, e presença de núcleos GFP de interesse que usam o microscópio fluorescente. Nota: Não é necessário fixar os núcleos, ou para manchar para GFP se esses slides são analisadas razoavelmente rápido após a preparação (dentro de 24 horas). </li></ol></li><li> Transferência de 10 ul do homogenato filtrado para um novo tubo de 1,5 mL e adicionar 90 ul de tampão de lavagem (1x PBS, pH 7,4, 2,5 mM de MgCl2). Adicionar DAPI para uma concentração final de 0,1 ug / ml, e incubar em gelo durante 10 min. Determine o rendimento núcleos na amostra pré-isolamento usando um hemocitômetro para contar os núcleos DAPI-positivos usando epifluorescência sob um objetivo ar 10X. </li></ol></li><li> Colocar o tubo de 1,5 ml contendo as contas de anticorpo ligado (preparado na secção 2.1.6) num rack magnético,e permitir que as pérolas magnéticas de se ligar ao íman, pelo menos, 2 minutos, conforme descrito na secção 2.1.4. Remover o tampão de lavagem das pérolas com o anticorpo ligado, usando uma pipeta de 1 ml, e adiciona-se o homogeneizado filtrado do passo 2.5 para o tubo de 1,5 ml usando uma pipeta de 1 ml. </li><li> Inverter o tubo várias vezes para misturar e incubar a 4 ° C durante 30 min com extremidade-sobre-extremidade agitação. Evitar bolhas no tubo, se possível, uma vez que estas podem resultar na aglomeração dos núcleos. </li><li> Colocar o tubo de 1,5 ml contendo as contas e homogeneizado ligados a anticorpos em uma cremalheira magnética, e permitem que as esferas magnéticas para se ligar ao íman, pelo menos, 2 minutos, conforme descrito na secção 2.1.4. Remover o homogenato contendo a fracção de núcleos não ligada, utilizando uma pipeta de 1 ml. </li><li> Lava-se a amostra 3x com 1 ml de tampão de lavagem de cada vez. Remover o tubo de 1,5 ml contendo as contas de vidro, núcleos ligados e tampão de lavagem a partir da prateleira e inverter a mistura várias vezes, em seguida, colocar o tubo na cremalheira magnético como descritono passo 2.9 e remover o sobrenadante utilizando uma pipeta de 1 ml. </li><li> Adicionar 150 ul de tampão de lavagem para os grânulos, os quais devem ser ligados aos núcleos de alvo. Esta é a amostra de pós-isolamento. Preparar amostras para análise de microscopia e extração de RNA subseqüente. <ol><li> Transferir 20 uL da amostra de pós-isolamento de um novo tubo de 1,5 ml e mancha com DAPI e analisar tal como descrito na secção 2.6.2. Contar o GFP + / + e DAPI GFP-/DAPI + núcleos capturados por esferas magnéticas para determinar a pureza da GFP enriquecido + núcleos na amostra de pós-isolamento. </li><li> Adicionar 1 ml de reagente Trizol para o restante da amostra de pós-isolamento, inverter para misturar e armazenar a -20 ° C para subsequente isolamento de ARN (passo 3.1). Nota: As amostras em Trizol pode ser armazenada durante várias semanas, caso seja necessário a -20 ° C. Não é necessário para eluir os núcleos dos grânulos magnéticos antes da extracção de ARN usando o reagente Trizol, because os grânulos não interferir com o subsequente isolamento do RNA. </li></ol></li></ol> 3. Determinar níveis de transcrição em núcleos isolados de tecidos larval <ol><li> Isolar RNA a partir das pré-isolamento e de pós-isolamento amostras preparadas nas seções 2.6.1 e 2.11.2 usando o protocolo padrão descrito para a extração de RNA baseado em Trizol (ver Materiais PDF) com as seguintes modificações: <ol><li> A seguir à precipitação do sedimento de ARN, adicionar 19,2 mL de água sem RNase e 0,8 ul de reagente RNASecure (ver Materiais PDF) para o sedimento e incubar a 60 ° C durante 20 min para inactivar ARNases. </li></ol></li><li> Determinar a concentração de RNA com um corante fluorescente de ligação-ARN, tais como o kit de ensaio de RNA Qubit (ver Materiais PDF) utilizando o 2,0 Fluorometer QubitR seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> Sintetizar ADNc, utilizando uma ampliação de transcriptase reversa, tais como a EpiScript kit da transcriptase reversa e iniciadores oligodT seguindo as instruções do fabricante. Nota: normalmente, de 50 a 100 ng de RNA gera ADNc suficiente para realizar a expressão de genes múltiplos análises. Quantidades equivalentes de pré-isolamento e RNA pós-isolamento deve ser utilizada para gerar ADNc. </li><li> Adicionar 180 mL de água isenta de nuclease para o cDNA de amostra de 20 ul para diluir este antes da análise em tempo real de 10 vezes por PCR quantitativa (qPCR). Esta diluição é um passo importante, porque as amostras não diluídas de cDNA pode inibir a qPCR. </li><li> Prepara-se uma mistura principal qPCR com polimerase e dNTPs, 4 pmoles de cada um de iniciador directo e inverso, fez-se com água esterilizada, para o volume de reacção final de 20 ul. <ol><li> Projete primers qPCR para atingir genes que são esperados para ser expressa no tipo celular de interesse, e no estágio de desenvolvimento em que o tecido é coletada. Conceber iniciadores para abrangem um intrão, se possível, de modo que genómico eprodutos de PCR de cDNA podem ser distinguidos. Nota: Se o perfil do tipo de célula alvo a expressão do gene não é conhecida, os iniciadores contra eGFP, que deve ser expresso especificamente na população de núcleos com etiquetas, pode ser utilizado para optimizar o protocolo para um tipo particular de células e tecidos (Tabela 1). </li></ol></li><li> Determinar os níveis relativos de transcritos de cada gene de interesse em amostras pré-e pós-isolamento de isolamento por comparação com uma série de diluição de cDNA preparado a partir de todo o tecido. Níveis de transcrição de genes-alvo deve ser normalizada a um gene de referência, tais como Rpl32 (ou, de preferência vários genes de referência). </li></ol>

<ol>
	<li>Weake, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcription+initiation+function+of+the+ubiquitous+SAGA+complex+in+tissue-specific+gene+activation.">Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation.</a> Genes Dev. 25, 1499-1509 (2011).</li><li>Bonn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+chromatin+immunoprecipitation+from+multicellular+complex+samples+using+BiTS-ChIP.">Cell type-specific chromatin immunoprecipitation from multicellular complex samples using BiTS-ChIP.</a> Nat. Protoc. 7, 978-994 (2012).</li><li>Haenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+C.+elegans+intestinal+gene+expression+and+polyadenylation+by+fluorescence-activated+nuclei+sorting+and+3'-end-seq.">Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6304-6318 (2012).</li><li>Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Vanier, C., Lynch, R. M., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+contributions+of+the+nuclear+and+cytoplasmic+compartments+to+global+gene+expression+in+human+cells.">Comparison of the contributions of the nuclear and cytoplasmic compartments to global gene expression in human cells.</a> BMC Genom. 8, 340 (2007).</li><li>Zhang, C., Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+characterization+of+cell-specific+gene+expression+through+fluorescence-activated+sorting+of+nuclei.">Global characterization of cell-specific gene expression through fluorescence-activated sorting of nuclei.</a> Plant Physiol. 147, 30-40 (2008).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana.">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nat. Protoc. 6, 56-68 (2011).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+gene+expression+and+chromatin+profiling+of+individual+cell+types+within+a+tissue.">A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue.</a> Dev Cell. 18, 1030-1040 (2010).</li><li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling.">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genom. Res. 22, 766-777 (2012).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+genomics+of+Drosophila+neurons.">Cell type-specific genomics of Drosophila neurons.</a> Nucleic Acids res. 40, 9691-9704 (2012).</li><li>Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KASH+and+SUN+proteins.">KASH and SUN proteins.</a> Curr Biol. 21, 414-415 (2011).</li><li>Fischer, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+klarsicht+has+distinct+subcellular+localization+domains+for+nuclear+envelope+and+microtubule+localization+in+the+eye.">Drosophila klarsicht has distinct subcellular localization domains for nuclear envelope and microtubule localization in the eye.</a> Genetics. 168, 1385-1393 (2004).</li><li>Patterson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+Klarsicht+and+nuclear+lamin+in+developmentally+regulated+nuclear+migrations+of+photoreceptor+cells+in+the+Drosophila+eye.">The functions of Klarsicht and nuclear lamin in developmentally regulated nuclear migrations of photoreceptor cells in the Drosophila eye.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 600-610 (2004).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+KASH+domain+protein+MSP-300+plays+an+essential+role+in+nuclear+anchoring+during+Drosophila+oogenesis.">The KASH domain protein MSP-300 plays an essential role in nuclear anchoring during Drosophila oogenesis.</a> Dev. Biol. 289, 336-345 (2006).</li><li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases.">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3312-3317 (2007).</li><li>Kracklauer, M. P., Banks, S. M., Xie, X., Wu, Y., Fischer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+klaroid+encodes+a+SUN+domain+protein+required+for+Klarsicht+localization+to+the+nuclear+envelope+and+nuclear+migration+in+the+eye.">Drosophila klaroid encodes a SUN domain protein required for Klarsicht localization to the nuclear envelope and nuclear migration in the eye.</a> Fly. 1, 75-85 (2007).</li><li>Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes.">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes.</a> Nat. Genet. 40, 476-483 (2008).</li><li>Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+glia+direct+axon+guidance+across+the+CNS/PNS+transition+zone.">Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone.</a> Dev. Biol. 238, 47-63 (2001).</li><li>Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+Drosophila+nervous+system.">Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7929-7933 (1982).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo pode ser utilizado para isolar ou enriquecer especificamente altamente núcleos marcados a partir de populações de células mistas na Drosophila embrionárias ou tecidos larvais. Usando este protocolo, os núcleos podem ser isoladas a partir de tecidos dissecados em aproximadamente 1 hora. A pureza e o rendimento dos núcleos isolados devem ser determinadas experimentalmente para cada tipo de célula. Pode ser difícil de quantificar os núcleos de talão ligado a na fase de pós-isolamento do ...

Tecidos de Drosophila, tais como o sistema nervoso central contém uma mistura complexa de tipos de células. Assim, para analisar os perfis de expressão de genes específicos de células a partir de tecidos de Drosophila, que é necessário em primeiro lugar isolar uma população homogénea de células específicas em quantidades suficientes para permitir aplicações a jusante. Os métodos para isolar as células de tecidos intactos incluem microdissecção a laser, e de células activadas por fluorescência (FACS) de células inteiras. Enquanto FACS tem sido usado para isolar as células e os núcleos a partir de embriões de Drosophila e de Caenorhabditis elegans para a expressão do gene e cromatina de perfis 1-3, FACS e microdissecção laser pode ser difícil de realizar com sucesso em tecidos que contêm tipos de células altamente misturados entre si ou que contêm células com morfologia irregular, tais como os neurónios. Para ultrapassar esta dificuldade, os núcleos, em vez de células podem ser isoladas a partir de tipos de células específicos e utilizado para subsequente gene perfil de expressão. Importante, com base em análise de expressão de mRNA microarray utilizando amostras de RNA nucleares apresenta resultados geralmente comparável à realizada utilizando RNA total 4, 5. Além disso, a análise da expressão de genes usando o RNA nuclear tem sido usado com êxito para estudar a expressão de genes em vários organismos, incluindo C. elegans, Arabidopsis thaliana, de Drosophila, e seres humanos 4, 5 2, 3. Várias abordagens têm sido recentemente descrita para o isolamento de populações específicas de núcleos marcados a partir de tecidos de Drosophila que são adequados para análise da expressão do gene e / ou da cromatina imunoprecipitação. O isolamento lote de cromatina tecido-específicas para o método de imunoprecipitação (bits-chip) utiliza FACS para isolar núcleos fixos com base na expressão de tipo específico de célula de energia nuclear localizada GFP 2. Esta abordagem tem sido successfully utilizado para analisar a distribuição de modificações de histonas e factores de transcrição, utilizando a imunoprecipitação da cromatina de núcleos isolados a partir da mesoderme de embriões de Drosophila 2. No entanto, as abordagens baseadas em FACS pode ser menos adequado para o isolamento de núcleos marcados que constituem apenas uma pequena proporção de uma população mista, devido ao aumento do tempo de classificação necessária para obter números adequados para aplicações a jusante. Para superar estas limitações, vários grupos têm utilizado técnicas de isolamento à base de afinidade para purificar os núcleos, que são marcadas com um epitopo específico de um tipo de célula particular. O isolamento dos núcleos marcados em tipos específicos de células de método (intacto) desenvolvidos para uso em Arabidopsis thaliana, 6, 7, foi recentemente adaptado para uso em Drosophila 8. Neste método, uma proteína de fusão de envelope nuclear que é um substrato para in vivo biotinilação é coexpressed com a Escherichia coli biotina ligase BirA em tipos específicos de células. Núcleos marcados com biotina podem ser, posteriormente, purificado a partir de populações mistas, utilizando a afinidade de isolamento à base de estreptavidina. Utilizando esta abordagem, os núcleos foram rotulados com sucesso e isolado a partir da mesoderme de embriões de Drosophila, em que uma proteína de fusão de envelope nuclear foi expresso sob o controlo de um potenciador específico para mesoderme 8. Os autores também geradas proteínas de fusão de envelope nucleares que podem ser expressas em qualquer tipo de células sob o controlo da sequência reguladora GAL4 UAS 9. Esta abordagem é capaz de isolar rapidamente subconjuntos de núcleos marcados a partir de populações mistas, mas requer três construções transgénicas separadas e podem, portanto, ser inadequada para aplicações genéticas particulares. Recentemente, uma aproximação tem sido descrita na qual SOL (S AD1 e C-84 da ONU) proteínas contendo o domínio que se localizam na membrana interior do envelope nuclear foram etiquetados comas proteínas fluorescentes e expresso sob o controlo do sistema Gal4/UAS 10. Os núcleos foram isolados na presença de detergente não iónico para remover a membrana externa do envelope nuclear, e de afinidade-purificada utilizando esferas magnéticas acopladas a anticorpos anti-GFP. Esta abordagem foi usada com sucesso para isolar pequenas populações de núcleos marcados de subtipos neuronais específicas no cérebro adulto de Drosophila 10. Aqui, um protocolo para o isolamento de núcleos marcados a partir de uma população mista de células a partir de tecido de larvas de Drosophila é descrito. Este método foi desenvolvido de forma independente, mas é semelhante ao método descrito por Henry et al. 10 Em primeiro lugar, os núcleos foram marcadas com um marcador fluorescente que é expresso apenas em tipos de células específicos em Drosophila melanogaster para facilitar o subsequente isolamento de núcleos marcados a partir de populações mistas usando uma abordagem baseada em afinidade. Para identificar os núcleos,foi utilizado o domínio KASH (K larsicht / D nc-1 / S ino h omology). O domínio KASH é um domínio de transmembrana que se localiza na membrana externa do envelope nuclear, em parte através de interacções com proteínas contendo o domínio SUN dentro do espaço perinuclear 11. O domínio KASH C-terminal de proteínas, tais como as de Drosophila MSP-300 e Klarsicht ancora estas proteínas para a membrana nuclear externa, ao passo que os seus domínios N-terminais interagir com proteínas do citoesqueleto tais como actina ou microtúbulos no citoplasma 12-14. As construções foram geradas em que o domínio de Drosophila KASH MSP-300 foi fundido com o terminal C de EGFP, sob o controlo da sequência reguladora GAL4 UAS no vector pUAST attB-15, 16. Usando a integração específica de sítio phiC31, moscas transgénicas foram geradas em que os UAS-EGFP :: MSP-300 KASH transgene foi inserido no locus no cromossoma attP23L 17. A UAS-EGFP :: MSP-300 KASH moscas podem ser cruzadas com moscas que expressam Gal4 o condutor em um tipo particular de células, o que resulta na expressão do alvo de EGFP na membrana nuclear externa no tipo celular de interesse. Núcleos marcados podem então ser purificados a partir de populações de células misturadas, utilizando anticorpos contra GFP acoplados a esferas magnéticas. Nesta abordagem, não é necessária a utilização de detergente não iónico, porque a etiqueta de EGFP está localizada ao lado citoplasmático da membrana nuclear externa, e é, portanto, acessível aos anticorpos. O protocolo abaixo descrito pode ser utilizado para isolar / enriquecer núcleos marcados com EGFP de tipos específicos de células de Drosophila em tecidos larvais, para quantificar a pureza e o rendimento de núcleos isolados, e para extrair o RNA nuclear apropriado para a transcrição reversa-reacção da polimerase em cadeia quantitativa (qRT -PCR), a análise da expressão do gene. O isolamento e purificação de afinidade-núcleos (excluindo tissue dissecção) pode ser realizada em menos de uma hora. Os resultados são apresentados mostrando que os núcleos da glia podem ser isolados com sucesso a partir do lóbulo óptica das larvas e do olho do disco imaginal, e usado para posterior análise da expressão do gene. Prevê-se que esta abordagem seja útil para o isolamento / enriquecimento de núcleos marcados a partir de tecidos embrionários e de larvas, em que as células alvo constituem menos de 5% da população geral. Todas as ações de Drosophila e plasmídeos gerados por este estudo estão disponíveis a partir dos autores, mediante solicitação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1884">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)</td>
			<td style="width:263px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:195px;">mAB24B10</td>
			<td style="width:828px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814460001</td>
			<td>This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>BEQPCR-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dounce Homogenizer (1 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62400-595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Tweezers, 11 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td>This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EpiScript Reverse Transcriptase</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>ERT12910K</td>
			<td><a href="http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf">http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon cell strainers, 40 &#956;m pore size</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-949</td>
			<td>Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>LSKMAGS08&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Mini tube rotator</td>
			<td style="width:263px;">Genemate</td>
			<td style="width:195px;">H-6700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:599px;">Qubit starter kit</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:195px;">Q32871</td>
			<td style="width:828px;">Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">RNAsecure (Ambion)</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:195px;">AM7010</td>
			<td style="width:828px;">The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">RT-PCR machine Thermal Cycler</td>
			<td style="width:263px;">BioRad</td>
			<td style="width:195px;">CFX Connect Thermal Cycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Siliconized 9 well glass plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 - 460nm) excitation + yellow barrier</td>
			<td style="width:263px;">Nightsea</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td>This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:195px;">SMZ 745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Thermal Cycler</td>
			<td style="width:263px;">BioRad</td>
			<td style="width:195px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td>CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf" >http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0777-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity-based isolation of tagged nuclei from drosophila tissues for gene expression analysis

Tecidos embrionários e de larvas de Drosophila melanogaster, muitas vezes contêm uma mistura altamente heterogénea de tipos de células, o que pode complicar a análise da expressão dos genes nestes tecidos. Assim, para analisar os perfis de expressão de genes específicos de células a partir de tecidos de Drosophila, pode ser necessário isolar os tipos de células específicas, com elevada pureza e em rendimentos suficientes para aplicações a jusante, tais como o perfil de transcrição e imunoprecipitação da cromatina. No entanto, a morfologia celular irregular em tecidos, tais como o sistema nervoso central, juntamente com a população rara de tipos específicos de células nestes tecidos, pode apresentar desafios para os métodos tradicionais de isolamento de células, tais como por microdissecção laser e células activadas por fluorescência (FACS) . Aqui, uma abordagem alternativa para caracterizar os perfis de expressão de genes específicos de células usando o isolamento com base em afinidade de núcleos marcados, em vez de células intactas, está descrito. Núcleos do c específicoell tipo de interesse são geneticamente marcado com um marcador EGFP localizada envelope nuclear utilizando o sistema de expressão binário Gal4/UAS. Estes núcleos marcaram-EGFP pode ser isolado utilizando anticorpos contra GFP que são acoplados a esferas magnéticas. A abordagem descrita neste protocolo permite o isolamento de núcleos coerente de tipos de células específicas no sistema central nervoso larvas de Drosophila em elevado grau de pureza e em quantidades suficientes para análise de expressão, mesmo quando estes tipos de células compreendem menos de 2% da população total de células na tecido. Esta abordagem pode ser usada para isolar os núcleos a partir de uma ampla variedade de Drosophila embrionárias e tipos de células de larvas usando condutores Gal4 específicas, e podem ser úteis para o isolamento de núcleos a partir dos tipos de células que não são adequados para FACS ou microdissecção a laser.

O controlador de repo-GAL4 (Bloomington número de stock 7415) é expresso especificamente nas células da glia do sistema nervoso Drosophila em vários estágios de desenvolvimento 18. As moscas foram geradas que estavelmente expressam UEA-EGFP :: MSP-300 KASH sob o controlo do controlador de repo-GAL4 utilizando técnicas genéticas convencionais. Para caracterizar o padrão de expressão da EGFP :: KASH transgene nestes moscas, o padrão de expressão da GFP n...

Watch this Scientific Journal Video about Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis at JoVE.com

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis | Biology | Video

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Tecidos de Drosophila contêm muitas vezes uma mistura heterogénea de tipos celulares. Para examinar a expressão de genes em tipos específicos de células a partir de um tecido em particular, os núcleos podem ser geneticamente marcado e, subsequentemente, isolado usando uma abordagem baseada em afinidade. Isolado núcleos pode ser utilizado para aplicações a jusante, tais como a análise de expressão génica e imunoprecipitação da cromatina.

Isolamento à base de Afinidade de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos para Análise de Expressão Gênica

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

affinity-based-isolation-tagged-nuclei-from-drosophila-tissues-for

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Genetics

Gene Expression

SCIENTISTS IN ACTION

14.6K visualizações.  Purdue University.  Tecidos de Drosophila contêm muitas vezes uma mistura heterogénea de tipos celulares. Para examinar a expressão de genes em tipos específicos de células a partir de um tecido em particular, os núcleos podem ser geneticamente marcado e, subsequentemente, isolado usando uma abordagem baseada em afinidade. Isolado núcleos pode ser utilizado para aplicações a jusante, tais como a análise de expressão génica e imunoprecipitação da cromatina. 

Vídeo: Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Isolamento de RNA Síntese Zebrafish e cDNA embrionárias para Análise de Expressão Gênica

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Robótica e Análise de Imagem Dinâmica de Estudos de Expressão Gênica em Tecidos Vegetais

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.