Projeto de recuperação da piscina e oligo <ol><li> O primeiro passo é projetar a piscina pré-mRNA a ser estudado. Isto pode ser feito usando o navegador do Genoma UCSC e download de genes particular, junções de emenda, ou outras áreas de interesse. </li><li> Uma vez que as janelas de interesse foram selecionados, entre eles telha computacionalmente usando as seguintes condições: comprimento ler deve ser de 30 a 10 nucleotídeos com sobreposição de nucleotídeos, portanto, cada oligo é deslocado 20 nucleotídeos a partir da uma prévia. * Oligo sobreposição deve ser aumentada na proximidade de sítios de splice para garantir a cobertura adequada, aumentando a sobreposição 10-20 nucleotídeos pode fazer isso. </li><li> Flanco oligo cada 30 nucleotídeos com seqüências de primer universal, que será usado para amplificar a jusante da piscina. Ordens de azulejos oligo devem ser submetidos a Agilent, onde as seqüências serão impressos em um microarray oligonucleotídeo personalizado. </li><li> Para recuperar os oligos DNA a partir da superfície microarray começar por colocar a cobertura deslizante matriz em uma câmara de hibridação array e gentilmente pipetagem 500 mL de dH 2 O para o slide </li><li> Sandwich matriz em cima do slide tampa, tendo o cuidado de evitar bolhas de ar que podem prejudicar o processo. Certifique-se de colocar o rosto disposição para baixo assim que o lado com o oligos está tocando a superfície da água. Uma boa regra de ouro é &quot;Agilent Agilent toca&quot; o que significa que o rótulo Agilent sobre a matriz enfrenta o rótulo Agilent no slide cobrir </li><li> Feche a câmara de hibridação e girar durante a noite a 99 ° C em um forno de hibridização </li><li> No dia seguinte, retire cuidadosamente a matriz da câmara e tirar fora da água, que agora contém os oligos liberados a partir da superfície da matriz. Esta é a piscina oligo </li><li> Coloque a piscina em um tubo Eppendorf 1,5 ml e sonicate da piscina em amplitude de 50% por 3-5 pulsos segunda </li><li> Em seguida, ampliar a piscina por baixo ciclo PCR, utilizando os primers universais com uma tag T7 anexados ao final. Para a primeira rodada, desnaturar a 94 ° C por 1 minuto, recozer a 55 ° C por 20 segundos, e alongada por 1 minuto a 72 ° C. Para as rodadas subseqüentes, fazer 10 segundos, 20 segundos e 10 segundos em cada temperatura respectivos, com uma etapa de alongamento final de 5 minutos a 72 ° C. Porque o número de ciclos necessários para amplificar a piscina depende da eficiência de recuperação oligo, pode ser necessário tentar números ciclo múltiplas. Tenha cuidado para não sobre-amplificar a piscina, que é representado por uma faixa manchada em um gel de acrilamida. Amostras de PCR amplificado podem ser armazenados a 4 ° C até ser necessário. </li><li> O passo final na preparação oligo é a transcrever RNA usando o MEGAshortscript Kit ™ do Ambion. * O protocolo a seguir foi adaptado de Ambion <ol class="lalpha"><li> Descongele a T7 Tampão de reacção de 10x, quatro soluções ribonucleotídeo e água à temperatura ambiente, mantendo o Mix de enzimas T7 no gelo </li><li> Montar a mistura de reação em um tubo de microcentrífuga RNase em temperatura ambiente. Componentes do tampão de reação pode causar DNA template para precipitar se a reação é misturada no gelo. </li><li> Na seguinte ordem, pipeta 3 de água livre de nuclease mL, 2 mL do tampão de reação 10x, 2 mL de cada solução de 75 mM NTP, 5 mL de DNA modelo (o PCR amplificado piscina oligo) e 2 mL da enzima T7, para um volume final de 20 mL </li><li> Flick o tubo suavemente para misturar a reação, em seguida, brevemente microcentrifugue para recolher a mistura na parte inferior do tubo. </li><li> Incubar a reação em um termociclador a 37 ° C por 2 horas. Tempo de incubação será de modelo-dependente, portanto, pode ser necessário o uso de um experimento de tempo do curso para determinar o tempo de incubação ideais para a produção máxima </li><li> Depois de duas horas, retire o DNA template adicionando 1 mL de DNase Turbo para a reação e incubar a 37 ° C por mais 15 minutos </li><li> Terminar a reação e recuperar o RNA por extração de fenol / clorofórmio e precipitação de etanol. <ol class="lalpha"><li> Para um volume de reação de 20 mL, adicione 115 mL de dH 2 O e 15 mL de acetato de sódio 3 M para a reação. </li><li> Misture bem em seguida, adicione 75 mL de fenol e 75 mL de clorofórmio ácidas. Misturar a solução em vortex, depois de microcentrífuga por um minuto a 13.000 rpm à temperatura ambiente. Transferir a fase aquosa para um novo tubo e repetir a extracção </li><li> Transferir a fase aquosa para um novo tubo e adicionar 150 mL de clorofórmio. Vortex da mistura e centrífuga como antes. Transferir a fase aquosa para um novo tubo. </li></ol></li><li> Recuperar o RNA, adicionando dois volumes de 100% de etanol frio para a camada aquosa e misturando bem. Frio a mistura para um mínimo de 15 minutos a -20 ° C, em seguida, centrifugar a 4 ° C por 15 minutos na velocidade máxima para agregar as RNA. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 105 mL de 0,1 x Tampão Tris-EDTA (TE) .. </li></ol></li><li> É difícil remover todos os nucleotídeos livres a partir da reação Kit T7, portanto, para os resultados mais precisos, quantificar o RNA usando RiboGreen. <ol class="lalpha"><li> Para começar a quantificação, primeiro diluir o suficiente 1x TE, 2300 mL + 50μL/sample. </li><li> Em seguida, faça o RiboGreen. Você vai precisar de 1.000 mL + 50 mL / amostra. Para amostras de gama alta (1 mg / mL a 20 ng / mL) misturar a 1:200 RiboGreen em 1x TE; para as amostras de gama baixa (50 ng / ml a 1 ng / mL) misturar a 1:2000 RiboGreen em 1x TE ; Pipetar 50 mL de solução RiboGreen em cada poço de uma placa opaca, começando com A1 e se movendo para baixo, e não através </li><li> Diluir uma solução estoque RNA a 2 mcg / mL para as amostras de gama alta ou 100 ng / mL para as amostras de gama baixa </li><li> Utilizando as soluções de ações, crie uma curva padrão por seis subseqüentes 01:02 diluições do 2 mg / mL ou 100 ações originais ng / mL; Pipetar 240 mL do estoque em um tubo de strip PCR. Nos restantes sete tubos, pipetar 120 mL de TE 1x. Levar até 120 mL do estoque RNA bem, e misture com o tubo 2. Levar até 120 mL de tubo 2 e misture com tubo de 3. Repita até que o tubo 7. Tubo de 8 só terá TE e será o seu em branco. Pipetar 50 mL das soluções da curva padrão na placa opaca, A1: H2 (executar a curva duas vezes) </li><li> Em um novo tubo, misturar 45 mL de TE com 5 mL da piscina oligo e adicionar todos os 50 mL de um poço que contém 50 mL de RiboGreen. </li><li> Usando um leitor de placa de configurar o aparelho para ler a fluorescência a partir do topo depois de uma mistura de um minuto com um comprimento de onda de excitação de 485 nm e comprimento de onda de emissão de 530 nm e ler a placa </li><li> Use a curva padrão gerada para quantificar o RNA recuperado, o que deve ser armazenado a -20 ° C. </li></ol></li></ol> Co-imunoprecipitação da piscina com um oligo RNP de interesse <ol><li> Antes do início do co-imunoprecipitação, prepare a Proteína A e Dynabeads Proteína G da Invitrogen, misturando-os em uma proporção de 1:1 até um volume final de 50 mL por reação. Por exemplo, para duas reações, é necessário adicionar 50 mL cada de cada grânulo. </li><li> Use um suporte Separação Magnética como este de Novagen para manter as contas no lugar enquanto você remover o sobrenadante e lavar as contas duas vezes com um volume igual de frio 1x PBS </li><li> Depois da segunda lavagem, ressuspender as contas em igual volume de PBS 1x fria e adicione 2 ng do anticorpo por reação. Este montante pode variar dependendo do anticorpo, assim experimentação é necessário encontrar as condições ideais. </li><li> Incubar a mistura de anticorpos / talão overnight a 4 ° C em uma plataforma rotativa </li><li> Na parte da manhã, adicione 2 mg por reação de RNA total sonicado levedura para bloquear ligações não específicas, e rodar por mais 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Usando o rack magnético para manter as contas, remover o sobrenadante e lavar as contas duas vezes com PBS 1x frio, deixando o PBS a partir da segunda lavagem no tubo. </li><li> Retire novos tubos, um para cada reação e alíquota de 50 mL da mistura do grânulo em cada tubo. Vamos as contas se sentar enquanto preparava uma mistura principal </li><li> Para cada reação adicionar 200 ng da piscina oligo, uma relação equimolar de primers de proteção, 2 mg de RNA total em leveduras sonicado, 20 mL de extrato de HeLa nuclear (esta é a fonte RNP), e E buffer para reduzir o volume até 120 mL. Os primers de proteção são versões RNA dos primers universal. Modelos de ordem de transcrição dos primers universais com uma tag T7 anexados ao final, em seguida, transcrever RNA a partir de modelos usando o Kit MEGAshortscript ™. </li><li> Remover o sobrenadante do alíquotas de contas e miçangas ressuspender em 120 L do mix master. Rock the reações a 4 ° C por 1-2 horas. </li><li> Após a incubação, para cada reação, remover uma pequena alíquota (incluindo as contas) para um &quot;total&quot; amostra de RNA </li><li> Coloque o restante das reações na separação magnética de pé e retirar o sobrenadante. Embora não seja necessário analisar este fluxo a jusante, através da amostra, pode ser útil para salvar. </li><li> Lave as contas 1-2 vezes com 50 mL de frio 1x PBS. O RNA ligado ao anticorpo nas contas é a amostra &quot;IP&quot;. </li><li> Ressuspender o &quot;total&quot; eo &quot;IP&quot; contas em 50 mL de SDS 1% em tampão 0,1 x TE e calor as amostras a 65 ° C por 15 minutos para eluir o RNA. </li><li> Remover o sobrenadante, que agora contém o RNA que foi previamente ligado ao contas e limpa por extração de fenol / clorofórmio, seguido por uma precipitação de etanol. Secar o pellet e ressuspender em 50 mL tampão TE 0,1 x. </li></ol> Transcrição reversa e amplificação de co-IP amostras em preparação para a rotulagem aminoallyl <ol><li> Em seguida, as amostras de RNA devem ser transcritas e reverter PCR amplificado. Para a reação de transcrição reversa, use os primers reverse universal. </li><li> Para cada amostra, comece por misturar 1 mL deo primer reverso universal, com 1 mL do modelo RNA (a partir da reação de imunoprecipitação) e 10 mL de dH 2 O. Calor das reações a 70 ° C por 5 minutos e frio no gelo ou manter a 4 ° C. </li><li> Enquanto as amostras de arrefecer, completar o mix mestre seguinte. Para cada reação combinar 4 mL de 10 mM dNTPs, 2 mL de tampão Arrayscript 10x, um inibidor da RNase mL e 1 mL da enzima de transcrição reversa. Misturar bem e adicionar 8 mL da mistura de mestre para cada reação de transcrição reversa. </li><li> Use uma máquina de PCR para incubar as amostras a 42 ° C por 2 horas, seguido de 95 ° C por 5 minutos, depois de 4 ° C até as amostras são necessários para a amplificação. </li><li> Depois de reverter a transcrever as amostras de RNA, PCR amplificá-las utilizando os primers universais, com um dos primers contendo uma tag T7. O número de ciclos necessários para amplificar a piscina vai depender da eficiência da co-IP por isso pode ser necessário tentar vários ciclos. Cada reação requer 5 mL de tampão de reação 10x Taq, 0,2 mL de cada primer (100 mM), 1 mL do modelo cDNA (a partir da reação de transcrição reversa), 1 mL de 10 mM dNTPs, 42,2 mL de dH 2 O, e 0,4 mL de enzima Taq. Comece a PCR, incubando as amostras a 94 ° C por 3 minutos. Em seguida, para cada ciclo de desnaturar, a 94 ° C por 45 segundos, recozer a 55 ° C por 30 segundos, e alongar a 72 ° C por um minuto, com um alongamento final a 72 ° C por 10 minutos. </li><li> Em seguida, transcrever as amostras novamente usando o MEGAshortscript Kit ™, no entanto, desta vez adicione 2 mL de aminoallyl UTP, em vez do UTP T7. A UTP aminoallyl será usado para rotular a RNA com os corantes Cy. </li><li> Fenol / clorofórmio e etanol precipitar as amostras. Não use Glycoblue ou acetato de amónio, sendo que ambos podem interferir com a hibridização das amostras para a matriz. Secar o pellet e ressuspender em 4,5 mL de 0,1 M de carbonato de sódio. </li></ol> Amino-alil rotulagem de RNA com Corantes Cy <ol><li> Para iniciar o protocolo de rotulagem dissolver cada um dos corantes fluorescentes, Cy3 e Cy5, em 45 mL de DMSO. Para evitar a luz, envolva os tubos em papel alumínio e armazenar a -20 ° C no escuro </li><li> Adicionar 2,5 mL de água livre de nuclease de RNA de amostras e misture bem </li><li> Em seguida, adicione 3 mL de Cy3 à amostra &quot;total&quot;, e 3 mL de Cy5 à amostra &quot;IP&quot;. Incubar as amostras no escuro por uma hora à temperatura ambiente; A amostra Cy-3 ficará vermelho ou rosa, enquanto o Cy-5 ficará azul. </li><li> Para terminar a reação, adicionar 6 uL de 4 M hidroxilamina-HCl a cada amostra, misturar bem e girar rapidamente. Incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Purificar as amostras rotuladas por extração de fenol / clorofórmio, seguido pelo etanol precipitação e pellet ressuspender em 50 mL de 0,1 x TE </li></ol> Hibridizar amostras para o microarray usando o Agilent Kit Hibridação Matriz <ol><li> Comece a hibridização suavemente mistura de 50 mL de tampão de bloqueio de 10x, 140 mL de O H2 nuclease-free, 25 mL do Cy3 marcado pool &quot;total&quot;, 25 mL do Cy5 marcado pool &quot;IP&quot;, 10 mL do buffer de fragmentação 25x e 250 mL do tampão de hibridação 2x, tendo o cuidado de evitar a introdução de bolhas. Microcentrífuga a amostra rapidamente para recolher a solução no fundo do tubo e também para reduzir bolhas. </li><li> Coloque o slide cobrir o-ring na câmara de hibridação e cuidadosamente pipeta a solução para o slide. </li><li> Coloque a matriz de detecção em cima do slide capa a &quot;sanduíche&quot; a solução. Lembre-se de orientar a matriz slide para que o rótulo Agilent sobre a matriz enfrenta o rótulo Agilent no slide tampa. </li><li> Prender o sanduíche de slide / matriz na câmara de hibridação e girar a 50 ° C por 3 horas. </li><li> Enquanto a matriz está girando, faça o seguinte 50 soluções mL em 50 mL tubos cônicos: uma cônica preenchido com 50 ml de dH 2 O, duas soluções tampão 1x SCC, cada um em um tubo separado, e um tampão 2x SCC. </li><li> Após a incubação de três horas, cuidadosamente unclamp o sanduíche array / slide e coloque-o na 50 ml contendo o buffer SCC 2x. Usando um par de pinças, separar delicadamente a matriz a partir do slide tampa e retire a cobertura deslizante. Tenha cuidado para não tocar a matriz como o slide é puxado para fora. Feche a cônica e inverter cuidadosamente por 60 segundos. </li><li> Usando a pinça, a transferência da matriz para a solução SCC 1x, tampa do tubo, e inverter cuidadosamente por 1 minuto em seguida, transferir a matriz para a segunda solução SCC 1x e novamente inverter cuidadosamente por um minuto. </li><li> Por último, transferir a matriz para o tubo de dH 2 O e inverter cuidadosamente por 30 segundos. </li><li> Seca a matriz, colocando as bordas do slide em um Kimwipe. Continue a girar a matriz sobre o wipe certificando-se de não perturbar o lado que contém a oligos. </li><li> Coloque a matriz em secoum tubo de 50 mL vazio cônica e digitalização com um scanner Microarray </li></ol> Interpretando o Microarray <ol><li> O scanner microarray irá criar uma imagem TIF da matriz. Executar esta imagem através do software de extração de recursos Agilent, usando o arquivo de grade (fornecido pela Agilent), que é exclusivo para a sua piscina específica. </li><li> O software Agilent irá interpretar o sinal em cada recurso para criar um arquivo, que é analisado com um script Perl. O sinal em cada recurso é normalizar a intensidade total em que canal. Por exemplo, em um recurso especial no canal verde, a intensidade do canal verde para o recurso individual é dividida pela intensidade total do canal verde sobre todos os recursos. O resultado final é a relação entre log do canal vermelho sobre o canal verde em cada característica da matriz. </li><li> Os dados piscina oligo do microarray pode ser re-mapeados de volta para o genoma para obter uma imagem de onde, e como fortemente, a RNP de interesse vinculado. </li></ol> Figura 1. Esquema experimental <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1a.jpg" alt="Figura 1a" /> A. Tiling esquema. Depois de selecionar e baixar mRNA de pré-seqüências de interesse, a área de seleção é através de azulejos em 30 janelas de nucleotídeos que mudança em incrementos de 10 nucleotídeos. Universal cartilha flanco sítios de ligação de cada lado da janela. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1b.jpg" alt="Figura 1b" /> B. Matriz de Síntese. Ordens de azulejos oligo devem ser submetidos a Agilent, onde as seqüências serão impressos em um microarray oligonucleotídeo personalizado. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1c.jpg" alt="Figura 1c" /> C. Co-imunoprecipitação. Depois de ferver a oligos fora do array, incubar em HeLa extrato nuclear, em seguida, adicione o extrato de esferas magnéticas que são preparados com um anticorpo contra a RNP de interesse. Rótulo da piscina oligo começando com Cy3 ea piscina ligado IP com Cy5 e aplicam-se a matriz de detecção e digitalização. Figura 2. Anotação do genoma com análise de dados e de enriquecimento. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig2.jpg" alt="Figura 2" /> A. Converter a pontuação média em cada coordenada genômico a partir dos dados da matriz para base dez log e mapa que a pontuação para as coordenadas dadas. Uma ilustração desta etapa média é dada por 3 sobreposição de 30 nt oligos com pontuação de 2, 4 e 0,5, onde a pontuação média de enriquecimento para cada janela de 10 nt é graficamente acima. As regiões genômicas selecionados pode ser visualizada usando uma faixa personalizada no navegador Genoma USCS. A janela do navegador exemplo dado é no gene clta, onde os recursos gene (exons / introns / splicing alternativo, etc) são dadas ao longo do fundo e dezenas log média de enriquecimento do oligos PTB-bound são representados por barras verticais em vermelho escuro. PTB fortemente liga-se logo acima do exon 2 no trato polypyrimidine.

Ao fazer este procedimento é importante lembrar que a criação da piscina é flexível e aberto a modificações em uma ou outra o RNA ou o nível de proteína. No nível de RNA regiões ortólogos, mutações doença, polimorfismos ou mutações aleatórias podem ser introduzidos na seqüência de oligonucleotídeos. No nível de proteína do fator de ligação RNA podem ser modificados por fosforilação ou modificações pós-translacionais outros. Além disso, o ambiente de ligação pode ser manipulado para aumen...

a rapid high-throughput method for mapping ribonucleoproteins (rnps) on human pre-mrna

Seqüenciamento RNAs que co-immunoprecipitate (co-IP) com proteínas de ligação RNA tem aumentado nossa compreensão de splicing, demonstrando que a localização de ligação, muitas vezes influencia a função de um fator de splicing. No entanto, como em qualquer estratégia de amostragem a chance de identificar um RNA ligado a um fator de splicing é proporcional à sua abundância celular. Nós desenvolvemos um romance abordagem in vitro para o levantamento especificidade de ligação de outra forma transitória pré-mRNA. Esta abordagem utiliza uma piscina projetada especificamente oligonucleotídeo que as telhas em introns, exons, junções de emenda ou outros pré-mRNA. A piscina é submetido a algum tipo de seleção molecular. Aqui, nós demonstrar o método, separando o oligonucleotídeo em uma fração associados e não associados e utilizar uma estratégia de duas variedade de cores para gravar o enriquecimento de cada oligonucleotídeo na fração ligada. Os dados de matriz gera mapas de alta resolução com a capacidade de identificar sequências específicas e estruturais determinantes da ribonucleoproteína (RNP) obrigatórias para pré-mRNA. A única vantagem deste método é a sua capacidade para evitar o viés de amostragem para mRNA associado IP atual e técnicas SELEX, como a piscina foi especificamente projetado e sintetizado a partir do mRNA de pré-seqüência. A flexibilidade da piscina oligonucleotídeo é outra vantagem desde o experimentador escolhe quais as regiões para estudar e telha de diâmetro, adaptando a piscina para as suas necessidades individuais. Usando esta técnica, pode-se ensaio os efeitos de polimorfismos ou mutações na ligação em grande escala ou clone da biblioteca em um repórter de emenda funcional e identificar oligonucleotídeos que são enriquecidos na fração incluídos. Este romance in vitro de alta resolução esquema de mapeamento fornece uma forma única para estudar as interações RNP com transiente pré-mRNA espécies, cuja baixa abundância que torna difícil o estudo com atual em técnicas vivo.

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A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Devido à natureza transitória do pré-mRNA, pode ser difícil isolar e estudar<em&gt; In vivo</em&gt;. Aqui, apresentamos um romance<em&gt; In vitro</em&gt; Abordagem para investigar interações RNA-proteína usando um pool oligo sintéticos que as telhas em regiões selecionadas de pré-mRNA.

Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

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JoVE Journal

Biology

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

11.7K visualizações.  Brown University. Devido à natureza transitória do pré-mRNA, pode ser difícil isolar e estudar In vivo. Aqui, apresentamos um romance In vitro Abordagem para investigar interações RNA-proteína usando um pool oligo sintéticos que as telhas em regiões selecionadas de pré-mRNA.

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A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Um método de alto rendimento para estudar a morfologia global organela em S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Biologia

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Um método de alta taxa de transferência para Zebrafish criopreservação de espermatozóides e In Vitro Fertilização

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice Cap: Um Método para Crescer Arabidopsis Plantas e tomate em placas de 96 poços para High-Throughput Genotipagem

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

De alto rendimento cristalização de proteínas de membrana Usando o método Bicelle lipídico

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

Alta capacidade mapeamento físico de cromossomos usando Automated<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Bioquímica e Alto Rendimento Avaliação microscópica de massa gorda em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Geração de alta Chromatin Template DNA Immunoprecipitation Qualidade para seqüenciamento de alto rendimento (CHIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Um Método de alta capacidade para medição de Taxa de filtração glomerular em ratos conscientes

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microinjeções de ouriço do mar zigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

Um método para selecionar Aptamers de comutação Estrutura Aplicado a um colorimétrico nanopartículas de ouro Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...