Melhoramos o método RiboTag publicado anteriormente para reduzir significativamente o histórico. Isso torna a aplicação a modelos complexos como um sistema mutante mais simples do ponto de vista da análise e muito menos caro. Além da geração animal experimental, o método RiboTag é consideravelmente mais fácil e mais simples do que outros métodos para analisar mRNAs associados ao ribossomo.
Como todos os experimentos de RNA, condições livres rigorosas de RNase são fundamentais para o sucesso. Se você tem experiência limitada com RNA, verifique suas condições primeiro realizando uma extração básica de RNA e siga em frente. Demonstrando o procedimento será Lauren Chukrallah, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.
Para preparar o tampão de homogeneização, adicione 2,5 mililitros de uma tríplice molar no pH 7.4, cinco mililitros de um cloreto de potássio molar, 600 microliters de um cloreto de magnésio molar e 500 microliters de MP40 a um tubo de 50 mililitros. Adicione água tratada com pirocarbonato de diethyl ao tubo para levar o volume a 50 mililitros e misture até que todos os componentes sejam incorporados. Para preparar o tampão de lavagem de sal alto, adicione 2,5 mililitros de uma tríplice molar no pH 7.4, 15 mililitros de um cloreto de potássio molar, 600 microliters de um cloreto de magnésio molar e 500 microliters de MP40 a um tubo de 50 mililitros.
Leve-o ao volume de 50 mililitros em água tratada com pirocarbonato dietilo e misture até que todos os componentes sejam incorporados. Pré-pesar todos os tubos de amostra, registrar o peso e pré-esfriar em nitrogênio líquido. Argamassa estéril pré-fria, pilão e espátula de pesagem em gelo seco.
Em seguida, em gelo seco, use a argamassa estéril pré-resfriada e pilão para quebrar amostras de tecido congelado em pedaços grandes e moê-lo lentamente em um pó fino. Usando a espátula pré-resfriada, raspe o pó da argamassa em um tubo de coleta pré-resfriado, tomando cuidado para manter o gelo seco sempre que possível. Pese o tubo com o pó de tecido.
Calcule a massa de tecido subtraindo o peso inicial do tubo do peso do tubo com a amostra nele. Registo este valor para cálculo posterior dos volumes de buffer de lise. Prepare o tampão de lise adicionando 10 mililitros de dithiothreitol tampão de homogeneização, inibidor de RNase, Cicloheximida, heparina e um comprimido inibidor de protease.
Misture até que todos os componentes sejam incorporados e mantenha no gelo até usar. Para cada 100 miligramas de amostra, adicione um mililitro de tampão de lise. Com a mesma pipeta usada para adicionar o tampão de lise, pipeta cuidadosamente o lise resultante para cima e para baixo para fragmentar as células e misturar.
Continue a pipetar por geralmente 25 a 30 traçados até que a amostra não seja mais viscosa. Coloque as amostras no gelo por 10 minutos para lise. Em seguida, gire as amostras em uma centrífuga pré-resfriada a quatro graus Celsius por 10 minutos a 10.000 vezes g.
Uma grande pelota nublada se forma na parte inferior do tubo. Tomando cuidado para não perturbar a pelota, colete o lysate em um novo tubo e regise o volume de cada amostra. Para evitar a degradação da amostra, certifique-se de que as amostras permaneçam frias durante todo o protocolo restante armazenando no gelo ou em quatro graus Celsius sempre que possível.
Agora, calcule o volume necessário de contas magnéticas acopladas à proteína de ligação de anticorpos apropriada, proteína G.Para um mililitro de lysato, use 375 microliters de contas de proteína G para atingir 30 miligramas por mililitro. Coloque a solução de contas em um tubo de 1,7 mililitro em um rack de tubo magnético. Remova o solvente de contas e adicione um volume igual de tampão de lise fresco às contas.
Em um rotador de tubo de bancada definido para 20 RPM a quatro graus Celsius, gire o tubo cinco minutos para lavar. Coloque o tubo no rack do tubo magnético e remova o tampão de lavagem. Depois de repetir a lavagem mais duas vezes, adicione o tampão de lise no volume original para equilibrar as contas.
Armazene a quatro graus Celsius ou no gelo até usar. Adicione 50 microliters das contas equilibradas para cada mililitro de lise e gire a quatro graus Celsius por uma hora. Em seguida, coloque o tubo no rack de ímã e colete o lysate em um tubo fresco.
Descarte as contas usadas. Ao liseto, adicione 25 microliters das contas equilibradas para cada mililitro e gire a quatro graus Celsius por uma hora. Armazene as contas de proteína g equilibradas restantes a quatro graus Celsius durante a noite.
Pela manhã, coloque o tubo no rack de ímã e colete o lysate em um tubo fresco. Descarte as contas usadas. A partir do lise limpo, retenha 50 microliters como o controle de entrada da amostra.
Armazene a menos 80 graus Celsius. Para cada mililitro do lysate limpo, adicione cinco microgramas de anticorpo anti-HA. Para evitar a perda de amostras, sele a tampa do tubo com filme de laboratório e gire as amostras de 16 a 18 horas a quatro graus Celsius.
Para cada mililitro do lysate limpo, adicione 300 microliters de contas de proteína G. Reseal a tampa do tubo com filme de laboratório e gire por duas horas a quatro graus Celsius. Coloque o tubo de amostra no rack de ímã para permitir que as contas se separem do lysate IPed.
Pipeta fora de fluxo e descarte, retendo as contas. Adicione 800 microliters de tampão de lavagem de sal alto às contas. Coloque o tubo em um rotador por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Coloque o tubo de amostra no rack de ímã e deixe as contas se separarem da lavagem. Retire e descarte a lavagem. Adicione mais 800 microliters de tampão de lavagem de sal alto às contas.
Feche o tubo e deixe-o girar por cinco minutos a quatro graus Celsius. Coloque o tubo de amostra no rack de ímã e deixe as contas se separarem da lavagem. Retire e descarte a lavagem.
Repita a lavagem mais uma vez. Após a lavagem, adicione 3,5 microliters de 14,2 molar beta-mercaptoetanol às contas e misture por vórtice por 15 segundos. Extrair RNA usando um kit comercial de purificação de RNA de acordo com as instruções do fabricante.
Elute a amostra em 30 microliters de água livre RNase. Armazene a amostra a menos 80 graus Celsius. Neste estudo, muito pouco RNA foi isolado das amostras que não possuem Cre ou Rpl22HA demonstrando a eficácia deste protocolo para reduzir o fundo IP e isolar rnas ribossômicas marcadas pela HA genuínas.
Uma série de anticorpos nos protocolos de isolamento do RNA foram testados em amostras positivas de Cre e Rpl22HA. Esses resultados demonstram que a seleção de reagentes pode ter um impacto significativo na eficiência do IP. A eficácia do sistema RiboTag para isolar o RNA associado ao ribossomo foi examinada.
Tanto para os genótipos de entrada silvestre quanto para os genótipos de IP, a concentração de entrada foi significativamente maior do que a concentração de IP indicando que havia mais RNA na amostra de entrada. No total de pools de RNA, esperava-se que os valores do número de integridade do RNA fossem próximos de 10, com um RIN mais alto correlacionado com maior integridade e qualidade da amostra inferida. Embora as amostras de IP tivessem RIN inferior aos insumos, as RINs ainda estavam dentro de um intervalo aceitável e não dependiam do genótipo amostral.
Além de criar e manter as condições livres de RNase, os pesquisadores devem garantir que eles coletem e mantenham cada amostra sugerida. O RNA de entrada é especialmente fundamental para vários tipos de análises a jusante. Para o nosso laboratório, geralmente realizamos sequenciamento de RNA após a imunoprecipitação.
Isso nos permite consultar toda a cúpula da transcrição para associação ribossosome. As alternativas incluiriam análise de microarray ou RT-PCR quantitativo. Para nós, este sistema nos permite identificar alterações em RNAs associadas ao ribossomo com mutação de proteínas específicas de ligação de RNA.
