Departamento de Defesa (Prêmio Idea W81XWH-07-0406) - Para Ulus Atasoy NIH RO1 A1080870 - Para Ulus Atasoy NIH R21 A1079341 - Para Ulus Atasoy Universidade de Missouri Fundos Institucionais - Para Ulus Atasoy

Preparação experiência Antes de iniciar o experimento, é fundamental ter todos os reagentes, recipientes e utensílios RNAse. Tratar vidro com RNase inibidor (RNaseZAP, Ambion) seguido de lavagem com água tratada com DEPC. Garantir que todos os reagentes são confirmados como RNase livre. 1. Prepare mRNP Lysate <ol><li> Cultivar e colher as células de tecido em crescimento exponencial para produzir entre 2-5 mg de proteína total, para cada RIP. <ol class="lalpha"><li> Dois P150 placas de cultura geral, são suficientes. </li><li> Para cada RBP sendo investigado, o total de celulares quantidades numéricas e proteína deve ser otimizado para maximizar mRNA alvo apropriado e interações da RBP. </li><li> RIP por qRT-PCR pode exigir lisado celular inferior (cerca de 400 ug de proteína total), devido à sua amplificação e método de detecção, especialmente para RBPs abundância elevados, tais como Hur, AUF1, TIAR. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Células de pelotas através de centrifugação a 200 xg, durante 8-10 min a 4 ° C, em seguida, lavar três vezes com PBS gelado. </li><li> Após a lavagem final, suavemente flick o fundo do tubo e ressuspender pellet celular em volumes iguais de tampão de lise preparado polissoma (PLB), com inibidores de RNase e protease. <ol class="lalpha"><li> É recomendado para medir o volume exato de pellet celular. </li></ol></li><li> Mistura suavemente pipeta (não vórtice) para quebrar aglomerados de células e incubar lisado em gelo durante 5 min. </li><li> Centrifugar a 13.000 xg durante 20 min a 4 ° C, para limpar o lisado de detritos. </li><li> Transferir imediatamente apagado sobrenadante para pré-refrigerada tubo de microcentrífuga. </li><li> Manter em gelo e armazenar a -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Congelamento imediato completa a lise eficaz das células e impede a ligação indesejada. Prossiga com RIP degelo amostra imediatamente a seguir e manter amostras de gelo para evitar a degradação do RNA. &lt;/ Li&gt; <li> Este lisado pode ser armazenado durante até seis meses a -80 ° C. Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, pois isso pode levar a proteína e / ou a degradação do mRNA. </li></ol></li><li> Quantificar a concentração de proteína de lisado usando o padrão de ensaio de proteína de Bradford. </li></ol> 2. Proteína um casaco de Contas Sepharose com anticorpo e Wash <ol><li> Pré-inchamento proteína A-Sepharose (PAS) grânulos durante a noite em tampão de NT2 (3-4 volumes) com BSA a 5%. Armazenar a 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Armazenamento a longo prazo de vários meses a 4 ° C é possível quando suplementado com azida de sódio a 0,1%. </li><li> Pérolas de Sepharose de proteína devem ser escolhidos com base no isotipo do anticorpo RBP alvo. Proteínas A, G e A / G tem todos os alvos específicos de isotipos e variam em afinidade alvo. Pérolas de proteína A-Sepharose foram utilizados com base na especificidade e afinidade para o isotipo do anticorpo a proteína Hur. </li></ol></li><li> Antes da utilização, remover o tampão de NT2 em excesso, de modoque as contas finais para tampão que é de 1:1. </li><li> Utilizando os tubos de 1,5 ml de RNAse-livre de microcentrífuga, remover 100 ul de suspensão de PAS e adicionar 30 mg de anticorpo para cada reacção de IP individual (ou seja, a RBP específico e de controlo de isotipo). </li><li> Adicione 100-200 ul de tampão de NT2 mistura do anticorpo do grânulo. <ol class="lalpha"><li> Mistura pode ser conservada durante várias semanas a 4 ° C quando suplementado com azida de sódio a 0,1%. </li><li> Um anticorpo isotipo-combinado ou soro normal de todo mesmas espécies devem ser utilizados em paralelo como um controlo de anticorpo contra ARN de fundo. </li></ol></li><li> Adicionar anticorpo apropriado para mistura de esferas e incubar durante a noite, caindo sobre a extremidade final a 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Optimizar a título de anticorpos para a proteína específica que está sendo pesquisado (1, 5, 10 ou 30 | ig de anticorpo é geralmente suficiente). </li></ol></li><li> Preparar pérolas revestidas com anticorpo imediatamente antes da utilização, por lavagem com 1 ml degelada tampão NT2 5 vezes. <ol class="lalpha"><li> Lavar mistura de esferas por meio de centrifugação a 13.000 xg, durante 1-2 min a 4 ° C. </li><li> Remova cuidadosamente a quantidade máxima de sobrenadante com pipeta de mão ou aspirador, mas tome cuidado para evitar a perturbação da pelota. </li><li> Lavagem ajuda a remover o anticorpo não ligado, assim como contaminantes de RNase mistura de anticorpos. </li></ol></li><li> Uma vez que a lavagem final ter sido concluída, voltar a suspender as pérolas em 700 ul de tampão gelado NT2 seguido por tratamento com vários inibidores de RNase para proteger os mRNAs alvo, incluindo 10 uL de RNase Out, 40 U / ul, 10 ul de 100 mM DTT e 15 ul de EDTA (15 mM). Levar o volume a 1000 uL com tampão de NT2. <ol class="lalpha"><li> Complexos de ribonucleósido de vanadilo não são usados ​​devido ao efeito inibitório do EDTA. </li></ol></li></ol> 3. Imunoprecipitação e RNA Precipitação <ol><li> Passo Preclear opcional:<ol class="lalpha"><li> Para reduzir o fundo, contas e do anticorpo de controlo pode ser utilizado para pré-claro lisado. Isto pode reduzir o sinal na saída. </li><li> Este passo pode ser necessário para reduzir o fundo quando se faz IP seguido por microarranjo. Não é geralmente necessário para IP seguido por qRT-PCR. </li><li> Preclear com 15 ug de controlo de isotipo para 30 min / 4 ° C extremidade caindo sobre a extremidade. </li><li> Adicionar 50 ul de pérolas de preswollen PAS não-revestidos com anticorpo a partir do passo 2.1. </li><li> Incubar 30 min / 4 ° C com rotação sobre a extremidade final </li><li> Centrifugar a 10.000 xg a 4 ° C. Guarde o sobrenadante para IP. </li></ol></li><li> Adicionar 100 ul de ligado clarificado isolado (aproximadamente 2-5 mg) à mistura de anticorpo preparada. <ol class="lalpha"><li> Diluindo lisado vai ajudar a reduzir o fundo e ligação não específica. </li><li> Quantidade de entrada de lisado pode variar dependendo do método de detecção e a abundância de RBP or a eficiência do anticorpo RBP como observado no passo 1.1.c. </li></ol></li><li> (Opcional) Imediatamente misturar tubo suavemente flicking várias vezes seguidas por centrifugação breve a 10.000 xg a 4 ° C para grânulos aglomerados e remover imediatamente 100 pi de sobrenadante como uma representação total de entrada de mRNA por qPCR análise usando técnicas de isolamento convencionais de ARN. <ol class="lalpha"><li> Este passo é confirmar que a entrada lisado RNA é ideal para IP e só deve ser realizada como uma etapa de seleção ou como um passo de solução de problemas seguindo RIP com maus resultados de RNA. </li></ol></li><li> Tubo envoltório em parafilme para assegurar uma vedação estanque e incubar a 4 ° C durante 2 a 4 horas, caindo sobre a extremidade final. <ol class="lalpha"><li> Temporização em incubação deve ser optimizada com base na abundância alvo e deve ser minimizada para evitar o rearranjo complexo ou degradação. Para algumas RBPs incubações mais curtos pode ser mais optimizada. </li></ol></li><li> Grânulos de pelotas em 5000 xgfou 5 min a 4 ° C e guarde o sobrenadante para análise por Western blot potencial. Alíquotas de armazenar a -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Alíquotas de sobrenadante com quantidades elevadas de proteína alvo residual pode indicar um defeito da proteína a ser precipitado por pérolas de sefarose. </li></ol></li><li> Como descrito anteriormente, lavar grânulos 5 vezes com 1 ml de tampão arrefecido com gelo e centrifugação NT2 (5000 xg durante 5 min a 4 ° C), em seguida, remover o sobrenadante com pipetador de mão ou um aspirador. <ol class="lalpha"><li> Métodos de lavagem mais severas podem ser usados ​​a fim de reduzir o fundo, completando NT2 tampão com desoxicolato de sódio, ureia ou SDS. </li><li> Manter as amostras sobre gelo tanto quanto possível e trabalhar rapidamente para minimizar a degradação do mRNA alvo. </li></ol></li><li> Opcional: Guardar numa pequena alíquota (10%) da mistura de esferas ou de executar uma amostra adicional, em paralelo para verificar a eficiência de IP da proteína alvo, utilizando análise de Western blot.</li></ol> 4. DNase e Tratamentos proteinase K <ol><li> Após a lavagem, os grânulos Ressuspenda com 100 ul de tampão NT2 suplementado com 5 uL de RNase-free DNase 1 (2 U / ul). </li><li> Manter a 37 ° C durante 5-10 min. Adicionar 1 ml de tampão NT2 e centrifugar a 5000 g durante 1 min à temperatura ambiente. <ol class="lalpha"><li> Uma alíquota (~ 10%) de pequenas esferas pode ser utilizado para verificar a eficiência de IP por análise SDS-PAGE. </li></ol></li><li> Ressuspender o sedimento em 100 PAS tampão NT2 ul, 5 jil de proteinase K (10 mg / ml), e 1 ul de SDS a 10%. </li><li> Incubar a mistura de grânulo ressuspenso durante 30 min a 55 ° C num banho de água, suavemente sacudindo a cada 10 min. <ol class="lalpha"><li> Proteinase K vai ajudar na liberação dos componentes da RNP. </li></ol></li><li> Grânulos de pelotas a 5000 xg durante 5 min à temperatura ambiente (RT) e recolhe-se o sobrenadante (~ 100 uL). </li><li> Adicionar 200 ul de tampão NT2 a esferas, centrifuge 5000 xg durante 2 min a RT, recolher o sobrenadante (~ pi 200), e os grânulos de descarte. </li><li> Combinar os sobrenadantes (100 uL e 200 uL) e adicionar 300 uL da camada inferior de ácido fenol-CHCl 3. </li><li> Vortex, 1 min RT (ou 37 ° C, em agitador) e centrifugação a 16.000 xg à temperatura ambiente durante 1 min. </li><li> Recolher 250 uL da camada superior (não perturbem interface), adicionar 25 ul de acetato de sódio a pH 5,2, 625 uL de ETOH a 100% e 5 ul glycoblue, e misturar bem. </li><li> Armazenar durante a noite a -20 ° C. <ol class="lalpha"><li> Para assegurar a recuperação adequada de RNA, a adição de glycoblue irá aumentar a visibilidade do sedimento de ARN, agindo como uma molécula transportadora. </li></ol></li><li> No dia seguinte, os tubos de centrifugação misturar por inversão 3-5 vezes, a 12000 xg a 4 ° C durante 30 min e desprezar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 1 ml de ETOH 70% para a pelota azul e misturar por inversão ou vortex. </li><li> Centrifugar 12.000 xg a 4 ° C durante 2 min. </li><li> Discard sobrenadante e centrifugue 12.000 xg durante 1 min a 4 ° C. </li><li> Remover qualquer ETOH residual de 70%, com uma pipeta e ar seco sedimento à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Ressuspender em 20-40 ul de RNase / DNase-livre de água ou de outro volume adequado, conforme necessário. <ol class="lalpha"><li> A amostra está agora pronta para aplicações a jusante, tais como qRT-PCR ou microarray. </li><li> Nanodrop espectrofotometria pode ser utilizado para avaliar a concentração da amostra, no entanto, com amostras preciosas, pode ser benéfico para evitar nanodropping amostras, uma vez que pode ser um desperdício e relativamente impreciso. Sugerimos amostras de normalização para transcritos do gene de limpeza para avaliar a pureza e eficiência IP para amostras preciosas ou de rendimento baixo. </li></ol></li></ol> 5. Resultados representativos Se o processo é optimizado e realizada correctamente, a imunoprecipitação deve produzir um enriquecimento significativo de alvos de RNAm. Tipicamente, Dependendo da RBP e seu alvo mRNA (s), vemos enriquecimento de cerca de 10 - a 50 vezes maior quando avaliada por qRT-PCR. Muitos alvos de RBPs pode ser descoberto em massa usando análise de microarray. No entanto, este método é mais sensível à degradação em comparação com qRT-PCR. Dependendo da RBP, o número de alvos e a eficiência da reacção, o microarray pode revelar centenas de novos alvos, ou pode apenas revelar algumas, se houver. Por exemplo, um dos mais bem caracterizadas proteínas de ligação de ARN Hur, pós-transcricionalmente regula a expressão e tradução de muitos genes importantes fisiológicas 1, 2. O isolamento do-Hur ribonucleo complexo via RIP-Chip em linhas celulares de cancro de mama, por exemplo, revelou enriquecimento de vários alvos importantes Hur conhecidos, incluindo β-actina utilizando qRT-PCR, como mostrado na Figura 1. Em ambas as linhas celulares de cancro β-actina é enriquecido 12 - a 15 vezes. Normalmente, quando realizada corretamente, vemos um significativo enrichment de β-actina em uma variedade de linhas celulares. No entanto, se o RIP não revela qualquer enriquecimento significativo para β-actina isto indica um problema com a RIP e o procedimento pode necessitar de ser repetido. Além disso, a análise de amostras de microarray imunoprecipitadas a partir destas linhas celulares revelou subconjuntos distintos de expressão alvos Hur em receptores de estrogénio (ER diferente) positivos células MCF-7 de cancro contra ER negativos MB-231 linhas celulares de cancro da mama, como demonstrado na Figura 2 1. Essas metas cair em várias categorias: metas Hur conhecidos e desconhecidos que foram associada ou não associada ao câncer. Por exemplo, CALM2 CD9 e são ambos genes do cancro, que não foram previamente identificadas como alvos Hur. Usando o microarray e confirmar com qRT-PCR, e CALM2 CD9 foram considerados 5 - a 180 vezes enriquecida no pellet Hur indicando uma interacção entre a proteína proeminente Hur e estes genes alvo. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpg&quot; alt = &quot;Figura 1&quot; /&gt; Figura 1. Imunoprecipitação e RIP em MB-231 (ER-) e MCF-7 (ER +) células de cancro da mama. Imunoprecipitações foram realizadas a partir de MB-231 ou de células MCF-7 lisados ​​utilizando anti-Hur anticorpo monoclonal (3A2) e IgG1 de controlo de isotipo. IP A. ocidental de Hur revelou banda tamanho esperado detectada por 3A2. Painel direito revela em quantidades de Hur em lisados ​​de entrada usado a partir de ambas as linhas celulares, com β-tubulina como controlo de carregamento. B. Verificação por RT-PCR quantitativa mostrou-15 e 11 vezes enriquecimentos de β-actina, um alvo conhecido Hur, nas IPs 3A2 de MB-231 e MCF-7, respectivamente. Todos os valores foram normalizados para ΔΔCT GAPDH. Experimentos foram realizados em duplicata (n = 2). <img src="/files/ftp_upload/3851/3851fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Hur RIP-CHIP identifica diferentes perfis genéticos em ER + e as células de câncer de mama ER-.Hur imunoprecipitações foram realizadas a partir de MB-231 ou de células MCF-7 lisados ​​utilizando o anticorpo Hur e controlo de isotipo IgG1 hibridado com matrizes Illumina Sentrix (47.000 genes). Os sinais de controlo foram subtraídos. Os resultados representam os dados cumulativos de 12 matrizes diferentes. As experiências foram realizadas em triplicado (n = 3) para cada linha de células com os controlos correspondentes. As escalas são log2.

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Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.

Devido à natureza desta experiência, optimização e experiência serão os únicos meios com sucesso garantidos para adquirir os resultados pretendidos. Em muitas etapas deste processo, a temperatura e a manipulação eficiente dos reagentes e produtos são extremamente importantes. Bom planejamento e execução da técnica irá ajudar a garantir que o experimento foi realizado em um prazo adequado para as temperaturas ideais recomendadas. Um grande problema com experiências de isolamento de ARN é a sensibilidade dos RNAs de degradação por RNases. Todos os reagentes devem ser RNase livre e armazenados ou usados ​​de RNase livre de recipientes. Este é um passo fundamental para garantir a integridade de sua amostra de mRNA. Mesmo quando a experiência for realizada correctamente, no entanto, o resultado desejado pode não ser conseguido, devido à natureza da interacção entre o RBP e mRNAs-alvo. Um problema potencial é ter baixo ou mesmo nenhum sinal da RNA isolado por RIP-Chip.Embora possa haver sinal a partir de ARN total, isto pode ser o resultado de a proteína de ligação inadequada sendo puxado para baixo por os grânulos. O passo de resolução de problemas é primeiro para confirmar que o lisado celular a ser utilizado tem a expressão adequada da RBP específico. Após a confirmação, a proteína pode ser isolado após a lavagem final, NT2 e ressuspensas em tampão de Laemmli ou outro tampão adequado de desnaturação e à temperatura de 95 ° C durante 5 min. A análise por Western blot pode ser utilizada com as amostras em coordenação com lisado de entrada, bem como controlos negativos para assegurar suficiente puxar para baixo de proteína associada. Além disso, porque a lise da célula é necessário para aceder a estes componentes, o potencial para interacções anormais entre proteínas e indesejáveis ​​normalmente separados e de mRNA podem ser introduzidos. Estas interações poderiam ligar e &quot;absorver&quot; mRNAs seu alvo ou proteínas de ligação através de interações inespecíficas. Além disso, as proteínas em co variando estesnditions pode dobrar em múltiplas variações e seus motivos de ligação pode se tornar inacessível para mRNAs-alvo, impedindo suas interações. Ambos reforçar a importância de se trabalhar eficientemente bem como utilizando as temperaturas óptimas listados para limitar estas interacções indesejáveis. Além disso, a optimização de condições de lavagem para cada proteína alvo específico serão críticos para maximizar a pureza da interacção. Condições de lavagem mais rigorosas podem ser necessários. Por exemplo, o tampão de lavagem pode ser completado com SDS ou de uma quantidade adequada de ureia para reduzir as interacções não específicas e de fundo na sua saída de sinal. Este será completamente dependente de RBP do experimentador alvo, bem como o ARNm alvo em suas únicas condições fisiológicas. Algumas condições não será adequado para ferramentas de mRNA certas análises, que devem ser observados na preparação de amostras. Finalmente, embora o RIP é bem sucedido no enriquecimento de RNA-RBP interacções, um problema bem conhecido com RIP método (CHIP) é a incapacidade de identificar os domínios de ligação específicos da RBP nos alvos de ARNm de transientes. Várias técnicas de ligação cruzada podem ser usados ​​seguindo-RIP para isolar alvos sequências únicas, no entanto, a utilização de ondas curtas UV tende a levar a danos de ácido nucleico. Um novo método denominado PAR-CLIP, ou de reticulação e ribonucleósido fotoactivável immuoprecipitation, emprega UV de onda longa para incorporar tiouridina em ARN nascentes que permitem a identificação de sítios de ligação únicos de interacções tanto estável e transitória de RNA. No geral, RIP-Chip foi estabelecida como uma excelente ferramenta usada para isolar e estudar as interações entre proteínas de ligação de RNA e das respectivas metas de mRNA por nosso grupo, assim como muitos outros grupos de pesquisa. Embora sensível por natureza e prática, boa execução deste procedimento irá produzir o isolamento desses complexos da RNP, que até recentemente, têm sido inaccessible para a descoberta e análise.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 1 M de ditiotreitol </td><td> Pescador </td><td> BP172-5 </td><td> TDT </td></tr><tr><td> DNase 1 </td><td> Ambion </td><td> 2235 </td><td> RNase livre </td></tr><tr><td> Ácido etilenodiaminotetracético Tetraccetic </td><td> Pescador </td><td> BP118-500 </td><td> EDTA </td></tr><tr><td> Glicogênio </td><td> Ambion </td><td> 9516 </td><td></td></tr><tr><td> 1 HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td><td> pH 7,0 </td></tr><tr><td> Igepal Nonidet P-40 </td><td> USB </td><td> 78641 </td><td> NP40 </td></tr><tr><td> 1 M KCl </td><td> Pescador </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M de MgCl2 </td><td> Pescador </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> NT2 Tampão </td><td> * Veja Abaixo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampão de Lise polissoma </td><td> * Veja Abaixo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Protease comprimidos de cocktail inibidor </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> Proteína A Sepharose Beads </td><td> Sigma </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Pescador </td><td> BP1700-100 </td><td></td></tr><tr><td> RNase Out inibidor RNase </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td> 40 U / ul </td></tr><tr><td> NaCl 1 M </td><td> Pescador </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Dodecil sulfato de sódio </td><td> Pescador </td><td> BP166-500 </td><td> SDS </td></tr><tr><td> 1 M de Tris-HCl </td><td> Pescador </td><td&gt; BP153-500 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-026 </td><td></td></tr><tr><td> Complexos de vanádio ribonucloesídeos </td><td> New England Labs </td><td> S1402S </td><td> VRC </td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><td> A manipulação de reagente </td></tr><tr><td> Preparar reagentes em RNase / DNase-livre, tratada com DEPC vidraria </td></tr><tr><td> Tampão de lise polissoma </td></tr><tr><td> 100 mM de KCl </td></tr><tr><td> 5 mM de MgCl2 </td></tr><tr><td> HEPES 10 mM (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 0,5% NP40 </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 100 unidades / ml de RNase Out </td></tr><tr><td> 400 uM VRC </td></tr><tr><td> Protease comprimido cocktail inibidor </td></tr><tr><td> 5 ml de tampão de lise polissoma </td></tr><tr><td> Adicionar 50 ul de HEPES 1 M (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 500 ul de 1 M KCl </td></tr><tr><td> 25 uL de 1 M de MgCl2 </td></tr><tr><td> 25 ul de NP40 </td></tr><tr><td> 4,7 ml de RNase DNase-livre H2O </td></tr><tr><td> 50 uL de 1 M DTT </td></tr><tr><td> 12,5 uL de 100 U / ml de RNase Out </td></tr><tr><td> 200 ul de mistura de inibidores de protease (dissolvido de acordo com o fabricante) </td></tr><tr><td> 10 ul de 200 mM VRC (no momento da utilização) </td></tr><tr><td> NT2 Tampão </td></tr><tr><td> 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 150 mM de NaCl </td></tr><tr><td> 1 mM de MgCl2 </td></tr><tr><td> 0,05% de NP40 </td></tr><tr><td> 1 L de tampão de NT2 </td></tr><tr><td> 50 ml de Tris (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 30 ml de NaCl 5 M </td></tr><tr><td> 1 ml 1 M MgCl <sub&gt; 2 </td></tr><tr><td> 500 NP40 ul </td></tr><tr><td> 820 ml de RNase DNase-livre H2O </td></tr></tbody></table>

method for the isolation and identification of mrnas, micrornas and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts using rip-chip

Como resultado do desenvolvimento de alto rendimento de sequenciação e análise de microarray eficiente, a análise de expressão génica global, tornou-se uma forma fácil e prontamente disponível de recolha de dados. Em muitas pesquisas e modelos de doenças no entanto, níveis estáveis ​​de mRNA do gene alvo nem sempre directamente correlacionadas com os níveis de proteína em estado estacionário. Pós-transcricional regulação gênica é a provável explicação para a divergência entre os dois. Impulsionado pela ligação de proteínas de ligação de ARN (RBP), regulação pós-transcricional afecta localização do mRNA, a estabilidade e a tradução através da formação de uma ribonucleoproteína (RNP) complexo com mRNAs alvo. A identificação dessas desconhecidos DE alvos de ARNm de novo a partir de extractos celulares do complexo RNP é fundamental para compreensão dos mecanismos e funções do RBP e o seu efeito sobre a produção de proteína resultante. Este protocolo descreve um método denominado RNP-imunoprecipitação de microarray (RIP-Chip), o que permite a identificação de smRNAs ESPECÍFICAS associado no complexo ribonucleoproteína, sob mudança condições experimentais, juntamente com opções para otimizar ainda mais uma experiência para o pesquisador individual. Com esta importante ferramenta experimental, os pesquisadores podem explorar os intrincados mecanismos associados com pós-transcricional regulação gênica, bem como interacções ribonucleoproteínas outros.

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Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Um passo a passo para protocolo de isolamento e identificação de RNA complexos associados através de RIP-Chip.

Método para o isolamento e identificação de mRNAs, microRNAs e componentes proteicos de complexos de ribonucleoproteínas de extratos celulares utilizando RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

method-for-isolation-identification-mrnas-micrornas-protein

Research

JoVE Journal

Biology

27.4K visualizações.  University of Missouri. Um passo a passo para protocolo de isolamento e identificação de RNA complexos associados através de RIP-Chip.

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Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Purificação e Visualização de Influenza A complexos de ribonucleoproteínas Viral

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Biologia

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identificação de complexos de proteínas com proteômica quantitativa em S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolamento de proteínas lábeis Multi-Complexos por In vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Imuno-magnética cromatografia de afinidade

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identificação e caracterização de glicosilação de proteínas específicas usando endo-e exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Identificação de modificações pós-translacionais de Complexos de proteína vegetal

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Isolamento de Blood-derivado do navio Multipotentes Precursores do músculo-esquelético humano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Mapeamento baseado em AFM das propriedades elásticas de paredes celulares: em tecido, os celulares, e as Resoluções Subcelulares

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Procedimento para avaliar a eficiência de floculantes para a Remoção de partículas dispersas de extractos de plantas

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing conditions could be achieved in different plant species. Native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from phloem samples have as yet scarcely been analyzed, although they might play important roles in maintenance of this specialized compartment or in long-distance signaling. Large molecular assemblies can be isolated using a blue native gel electrophoresis (BN-PAGE). Their protein components can be separated by a subsequent sodium dodecyl sulfate PAGE (SDS-PAGE). However, proteins with similar molecular weights co-migrate, what can hinder protein identification by mass spectrometry. Combining BN-PAGE with two different denaturing gel electrophoresis steps, namely Tris-Tricine-urea and SDS-PAGE, enables the additional separation of proteins according to their hydrophilicity/hydrophobicity and thus increases resolution and the success of protein identification. It even allows distinguishing proteins that only differ in their posttranslational modifications. In addition, blue native northern blotting can be applied to identify the RNA components in macromolecular complexes. We show that our protocol is suitable to unravel the protein and RNA components of native protein:protein and ribonucleoprotein (RNP) complexes occurring in phloem samples. Combining a blue native PAGE with two different denaturing PAGE steps can help to separate different kinds of large protein complexes, and also enables an increased identification rate of their components by mass spectrometry. Furthermore, the protocol is robust enough to simultaneously detect potentially bound nucleic acids within single protein complexes.

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Here we present a protocol to analyze the protein composition of large native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from oilseed rape (B. napus) phloem exudate using a 3D polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) approach combining blue native (BN) with two denaturing PAGEs followed by mass spectrometric identification.

Amostragem de seiva de floema de Brassica napus para 3D-PAGE de complexos de proteínas e ribonucleoproteínas

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...