Os autores agradecem a todos os membros dos laboratórios Ule, Luscombe e Zupan para discussão e assistência experimental. Agradecemos a James Hadfield e Nik Matthews para high-throughput seqüenciamento. Gostaríamos de salientar que o método descrito aqui iCLIP partes várias etapas com o protocolo CLIP original, desenvolvido por Kirk Jensen e JU no laboratório de Robert Darnell. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Europeu de Investigação conceder 206.726 CLIP-a JU e um longo prazo Human Frontiers Science Program comunhão de JK

1. UV ligação cruzada de cultura de tecidos de células <ol><li> Remova a mídia e adicionar 6 ml gelada PBS para as células cultivadas em uma placa de 10 cm (o suficiente para três experimentos). </li><li> Retire a tampa e colocar no gelo. Irradiar uma vez com 150 mJ / cm 2 a 254 nm. </li><li> Colheita das células por raspagem com um levantador de células. </li><li> Transferência de 2 ml de suspensão celular para cada uma das três microtubos. Giram em velocidade máxima por 10 segundos a 4 ° C para as células de pelotas, em seguida, remova o sobrenadante. </li><li> Snap-congelar as bolinhas de células em gelo seco e armazenar a -80 ° C até o uso. </li></ol> 2. Preparação do grânulo <ol><li> Adicionar 100 ul de proteína A Dynabeads (Dynal, 100,02) por experimento para um microtubo fresco (Use Dynabeads proteína G para um mouse ou anticorpos de cabra). </li><li> Lavar contas 2x com tampão (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS; desoxicolato de sódio 0,5%; 1 / 100 de inibidores da protease cocktail III, Calbiochem) lise. </li><li> Ressuspender contas em 100 mL com tampão de lise 20-10 mg de anticorpos. </li><li> Gire tubos à temperatura ambiente por 30-60 min. </li><li> Lavar 3x com 900 mL tampão de lise e deixar na última lavagem, até estar pronto para avançar para o passo 4.1. </li></ol> 3. Lise celular e digestão parcial RNA <ol><li> Ressuspender o pellet celular em um tampão de lise ml e transferir para 1,5 ml microtubos. </li><li> Prepare uma diluição de 1 / 500 da RNase I (Ambion, AM2295). Adicionar 10 ml de diluição RNase I, bem como 2 l Turbo DNase ao lisado celular (1 / 500 diluições RNase I [baixo RNase] são usados ​​para a preparação de biblioteca; 1 / 50 diluições [alta RNase] são necessárias para o controle para a especificidade de anticorpos) . </li><li> Incubar as amostras para exatamente 3 minutos a 37 ° C, agitando a 1.100 rpm. Transferir imediatamente para o gelo. </li><li> Girar a 4 ° C e 22.000 g por 20 min para limpar o lisado. Recolher com cuidado o sobrenadante (deixar cerca de 50 mL do lisado com a pelota). </li></ol> 4. Imunoprecipitação <ol><li> Remova o tampão de lavagem dos grânulos (a partir do passo 2.5), em seguida, adicione o lisado de células (do passo 3.4). </li><li> Gire as amostras por 2 horas a 4 ° C. </li><li> Desprezar o sobrenadante e lavar as contas 2x com 900 buffer de alta-sal mL (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 M NaCl; 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% desoxicolato de sódio). </li><li> Lavar 2x com 900 tampão de lavagem (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl 2; 0,2% Tween-20) mL. </li></ol> 5. Desfosforilação de RNA 3&#39;ends <ol><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender as contas em 20 mix PNK mL (15 mL de água, 4 mL pH 6,5 PNK 5x buffer [350mMTris-HCl, pH 6,5; 50mMMgCl 25mMdithiothreitol 2], 0,5 mL da enzima PNK, 0,5 mL RNasin [Promega]). </li><li> Incubar por 20 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar 500 mL de tampão de lavagem e lavar 1x com alto-sal buffer. </li><li> Lavar 2x com tampão de lavagem. </li></ol> 6. Ligadura vinculador a RNA 3 &#39;termina <ol><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender as contas em 20 mix ligadura mL (9 mL de água, 4 mL de buffer ligadura 4x [200 mMTris-HCl; MM 40m GCL 2; 40 ditiotreitol mM]; 1 ml RNA ligase [NEB], 0,5 mL RNasin [Promega]; 1,5 linker pré-adenylated mL L3 [20 mM], 4 mL PEG 400 [81170, Sigma]). </li><li> Incubar durante a 16 ° C. </li><li> Adicionar 500 mL de tampão de lavagem e depois lavar 2x com um buffer de alta-sal ml. </li><li> Lavar 2x com 1 ml tampão de lavagem e deixar em 1 ml da segunda lavagem. </li></ol> 7. Rotulagem RNA extremidade 5 &#39; <ol><li> Remover o sobrenadante e ressuspender as contas em 8 mL de mistura quente PNK (0,4 mL PNK [NEB]; 0,8 mL 32 P-γ-ATP; 0,8 mL de buffer PNK 10x [NEB]; 6 mL de água). </li><li> Incubar por 5 min a 37 ° C. </li><li> Retire a mistura quente e PNK ressuspender as contas em 20 l de tampão de carregamento Nupage 1x (Invitrogen). </li><li> Incubar em um Thermomixer a 70 ° C por 10 min. </li><li> Coloque imediatamente em um ímã para precipitar as contas vazio e carregar o sobrenadante no gel (veja passo 8). </li></ol> 8. SDS-PAGE e transferência de membrana <ol><li> Carregar as amostras em um NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Use 0,5 l de tampão de corrida MOPS 1x (Invitrogen). Também carga de 5 mL de um marcador de tamanho pré-manchada de proteína (por exemplo PAGE governante plus, Fermentas, SM1811). </li><li> Executar o gel por 50 min em 180 V. </li><li> Remova o gel frente e descarte de resíduos sólidos (contém livre radioativos ATP). </li><li> Transferência dos complexos de proteína-RNA do gel para uma membrana de nitrocelulose utilizando o aparelho de transferência Novex húmida de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, transferência de 1 hora a 30 V). </li><li> Após a transferência, lavar a membrana em tampão PBS, em seguida, envolvê-la em saran wrap e expô-la a um filme Fuji a -80 ° C (colocar um adesivo fluorescente próxima à membrana para depois alinhar tele cinema e da membrana; realizar exposições por 30 min, 1h e durante a noite). </li></ol> 9. RNA isolamento <ol><li> Isolar os complexos de proteína-RNA a partir do experimento de baixo RNase usando o autoradiograph a partir do passo 8.5 como uma máscara. Corte este pedaço de membrana em várias fatias e coloque-os em um microtubo de 1,5 ml. </li><li> Adicionar 200 mL de buffer PK (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA) e 10 ml proteinase K (Roche, 03115828001) para as peças de membrana. Incubar agitando a 1.100 rpm por 20 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar 200 mL de tampão PKurea (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA; 7 M uréia) e incubar por 20 min a 37 ° C. </li><li> Coletar a solução e adicioná-lo juntamente com 400 mL de RNA de fenol / clorofórmio (Ambion, 9722) para uma Fase 2 ml de bloqueio do tubo Gel pesados ​​(713-2536, VWR). </li><li> Incubar por 5 min a 30 ° C, agitando a 1.100 rpm. Separar as fases por fiação por 5 min a 13.000 rpm à temperatura ambiente. </li><li> Transferir a fase aquosa para um novo tubo (cuidado para não tocar no gel com a pipeta). Adicionar 0,5 mL glycoblue (Ambion, 9510) e 40 mL 3 M pH 5,5 e acetato de sódio mix. Em seguida, adicione 1 ml de etanol 100%, misture novamente e precipitar durante a noite a -20 ° C. </li></ol> 10. Transcrição reversa <ol><li> Giro por 20 min a 15.000 rpm e 4 ° C. Remover o sobrenadante e lavar o pellet com 0,5 ml de etanol 80%. </li><li> Ressuspender o sedimento em 7,25 mL de RNA / mix de primer (6,25 mL de água, 0,5 mL de primer Rclip [0.5pmol/μl], 0,5 mL de dNTP mix [10mM]). Para cada experiência ou replicar, use um primer Rclip diferentes contendo seqüências de códigos de barras individuais (ver 14). </li><li> Incubar por 5 min a 70 ° C antes do resfriamento a 25 ° C. </li><li> Adicionar 2,75 mL RT mix (2 mL tampão RT 5x, 0,5 mL 0,1 M DTT; 0,25 mL Sobrescrito III da transcriptase reversa [Invitrogen]). </li><li> Incubar 5 min a 25 ° C, 20 min a 42 ° C, 40 min a 50 ° C e 5 min a 80 ° C antes do resfriamento a 4 ° C. </li><li> Adicionar 90 mL tampão TE, 0,5 mL glycoblue e 10 mL de acetato de sódio pH 5,5 e misturar. Em seguida, adicione 250 mL de etanol 100%, misture novamente e precipitar durante a noite a -20 ° C. </li></ol> 11. Purificação em gel de cDNA <ol><li> Spin para baixo e lavar as amostras (ver 10.1), em seguida, voltar a suspender as pelotas em 6 mL de água. </li><li> Adicionar 6 mL de tampão de carregamento 2x TBE-uréia (Invitrogen). Amostras de calor a 80 ° C por 3 min directamente antes de carregar. </li><li> Carregar as amostras em um pré-moldado de 6% gel TBE-uréia (Invitrogen) e correr por 40 min a 180 V, conforme descrito pelo fabricante. Também carregar um marcador de baixo peso molecular de corte subseqüentes (veja abaixo). </li><li> Corte três bandas em 120-200 nt (alto), 85-120 nt (médio) e 70-85 nt (baixo). Use theupper dye e as marcas com o apoio gel de plástico para guiar a excisão (ver Figura 3). Note-se que o primer Rclip ea seqüência L3, juntos, respondem por 52 nt da seqüência CLIP. </li><li> Adicionar 400 mL de TE e esmagar a fatia de gel em pequenos pedaços usando uma um êmbolo da seringa ml. Incubar agitando a 1.100 rpm por 2 horas a 37 ° C. </li><li> Coloque dois um centímetro de vidro pré-filtros (Whatman, 1.823.010) em uma coluna Spinx Costar (Corning Incorporated, 8161). Transferir a parte líquida da amostra para a coluna. Rodada por 1 min a 13.000 rpm em um tubo de 1,5 ml. </li><li> Adicionar 0,5 mL glycoblue e 40 mL de acetato de sódio pH 5,5, em seguida, misturar a amostra. Adicionar 1 ml de etanol 100%, misture novamente e precipitar durante a noite a -20 ° C. </li></ol> 12. Ligadura de primer para o 5&#39;end do cDNA <ol><li> Spin para baixo e lavar as amostras (ver 10.1), em seguida, voltar a suspender as pelotas em 8 mix ligadura mL (6,5 mL de água e 0,8 mL 10x CircLigase buffer II; 0,4 mL 50 mM MnCl 2; 0,3 mL; Circligase II [Epicentre]) e incubar por 1 hora a 60 ° C. </li><li> Adicionar 30 mL de recozimento mix oligo (26 mL de água, 3 mL de buffer FastDigest [Fermentas]; 1 ml cut_oligo [10 mM]). Incubar por 1 min a 95 ° C. Então diminuir a temperatura a cada 20 segundos em 1 ° C até 25 ° C são atingidos. </li><li> Adicione 2 mL BamHI (Fermentas Fast) e incubar por 30 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar 50 mL TE e 0,5 glycoblue mL e misturar. Adicionar 10 mL de acetato de sódio pH 5,5 e misture, em seguida, adicione 250 mL de etanol 100%. Misture novamente e precipitar durante a noite a -20 ° C. </li></ol> 13. Amplificação por PCR <ol><li> Spin para baixo e lavar as amostras (ver 10.1), em seguida, ressuspender o sedimento em 19 mL de água. </li><li> Prepare a mistura de PCR (19 mL cDNA; 1 ml de primer mix P5/P3 Solexa, 10 mM cada; 20 mL Accuprime Supermix uma enzima [Invitrogen]). </li><li> Execute o programa de PCR seguinte: 94 ° C por 2 min, [94 ° C por 15 segundos, 65 ° C por 30 segundos, 68 ° C por 30 segundos] 25-35 ciclos, 68 ° C por 3 min, 4 ° C para sempre. </li><li> Mix 8 mL do produto PCR com 2 l de tampão TBE 5x de carga e de carga em um gel TBE pré-moldado de 6% (InvitRogen). Manchar o gel com Sybrgreen I (Invitrogen) e analisar com um gerador de imagens gel. </li><li> O código de barras na primers Rclip permitem amostras multiplex diferente antes de enviar para o seqüenciamento de alto rendimento. Apresentar 15 mL da biblioteca para o seqüenciamento e armazenar o resto. </li></ol> 14. Seqüências Linker e primer DNA linker pré-adenylated 3 &#39;: [Nós fim do adaptador de DNA a partir de IDT e fazer alíquotas de 20Hm.] <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig0.jpg" alt="DNA" /> 15. Resultados representativos: Antes de seqüenciamento da biblioteca iCLIP, o sucesso do experimento pode ser monitorado em duas etapas: a autoradiograph do complexo proteína-RNA após a transferência de membrana (passo 8.5) ea imagem gel dos produtos de PCR (passo 13.4). No autoradiograph das amostras de baixa RNase, a radioactividade difusa deve ser visto acima do peso molecular da proteína (Figura 2, amostra 4). De alta RNase amostras, a radioatividade é focado mais perto do peso molecular da proteína (Figura 2, amostra 3). Quando não há anticorpo é usado no imunoprecipitação, nenhum sinal devem ser detectados (Figura 2, as amostras 1 e 2). Mais importantes controles para a especificidade da imunoprecipitação ou omitir irradiação UV ou células uso que não expressam a proteína de interesse 14. A imagem do gel dos produtos de PCR (passo 13.4) deve mostrar uma faixa de tamanho que corresponde à fração de cDNA (alta, média ou baixa) purificada no passo 11.4 (Figura 4, faixas 4-6). Note que a PCR e primers P3Solexa P5Solexa introduzir um nt 76 adicionais para o tamanho do cDNA. Se nenhum anticorpo é usado durante a imunoprecipitação, nenhum produto correspondente PCR devem ser detectados (Figura 4, faixas 1-3). Produto dímero Primer pode aparecer em cerca de 140 nt. Para obter resultados representativos de high-throughput seqüenciamento e posterior análises de bioinformática ver 14. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Representação esquemática do protocolo iCLIP. Proteína-RNA complexos são covalentemente cruzada in vivo utilizando irradiação UV (passo 1). A proteína de interesse é purificado, juntamente com o RNA ligado (passos 2-5). Para permitir priming seqüência específica de transcrição reversa, um adaptador de RNA é ligada à extremidade 3 &#39;do RNA, enquanto que a extremidade 5&#39; é marcado radioativamente (passos 6 e 7). Cross-linked proteína-RNA complexos são purificados a partir de RNA livre usando SDS-PAGE e transferência de membrana (passo 8). O RNA é recuperado a partir da membrana por digerir a proteína com proteinase K deixando um polipeptídeo remanescente no cross-link nucleotídeo (passo 9). Transcrição reversa (RT) trunca no polipeptídeo restantes e apresenta duas regiões adaptador clivável e sequências de código de barras (passo 10). Seleção de tamanho remove cartilha RT livre antes de circularização. A linearização seguir gera modelos adequados para a amplificação PCR (passos 11-15). Finalmente, high-throughput seqüenciamento gera lê na qual as seqüências de códigos de barras são imediatamente seguidos por último nucleotídeo do cDNA (passo 16). Uma vez que este nucleotídeo localiza uma posição a montante do nucleotídeo cruzada, o sítio de ligação pode ser deduzida com alta resolução. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Autoradiograph de cross-linked hnRNP C-RNA complexos usando eletroforese em gel desnaturante e transferência de membrana. hnRNP C-RNA complexos foram imuno-purificada a partir de extratos de células usando um anticorpo contra hnRNP C (α hnRNP C, as amostras 3 e 4). RNA foi parcialmente digeridos com baixa (+) ou alta (+ +) concentração de RNase. Complexos deslocando para cima a partir do tamanho da proteína (40 kDa) pode ser observado (amostra 4). A mudança é menos pronunciado quando altas concentrações de RNase foram utilizados (amostra 3). O sinal radioativo desaparece quando não há anticorpos foi utilizado no imunoprecipitação (amostras 1 e 2). <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Esquemática 6% gel TBE-uréia (Invitrogen) para guiar a excisão de produtos iCLIP cDNA. O gel é executado por 40 min a 180 V levando a um padrão de migração reprodutível de cDNAs e corantes (luz e azul escuro) no gel. Use uma lâmina de barbear para cortar (linha vermelha) a alta (H), médio (M) e baixa (L) frações cDNA. Comece por cortar no meio do corante azul e imediatamente acima da marca na fita gel de plástico. Divide as frações de média e baixa e aparar a fração alta de cerca de 1 cm acima do corante azul claro. Use cortes verticais guiada pelo bolsos e o corante para separar as pistas diferentes (neste exemplo, 1-4). A pista marcador (m) pode ser manchado e fotografada para controlartamanhos após o corte. Tamanhos de fragmentos são indicados à direita. <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Análise de bibliotecas amplificado por PCR usando cDNA iCLIP eletroforese em gel. RNA recuperado da membrana (Figura 1) foi reverso transcrito e tamanho purificado utilizando eletroforese em gel desnaturante (Figura 2). Três frações de tamanho de cDNA (alta [H]: 120-200 nt, média [M]: 85-120 nt e de baixo [L]: 70-85 nt) foram recuperados, enviou notícias, re-linearizado e amplificado por PCR. Os produtos de PCR de distribuição de tamanho diferente pode ser observada como resultado dos tamanhos diferentes das frações de entrada. Uma vez que o primer PCR apresenta 76 nt para o cDNA, tamanhos deve variar entre 196-276 nt para alto, 161-196 nt para empresas de médio e 146-161 nt para frações tamanho reduzido. Os produtos de PCR estão ausentes quando nenhum anticorpo foi utilizado para a imunoprecipitação (faixas 1-3).

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Não há conflitos de interesse declarados.

Desde o protocolo iCLIP contém uma gama diversificada de reações enzimáticas e etapas de purificação, nem sempre é fácil identificar um problema quando um experimento falhar. No fim de controlar a especificidade da RNA identificados cross-link sites, um ou mais controles negativos deve ser mantida durante todo o experimento completo e subseqüentes análises computacionais. Esses controles podem ser a amostra não-anticorpo, as células não-cross-linked, ou imunoprecipitação a partir de células ou tecidos knockout. Idealmente, estes experimentos de controle não deve purificar quaisquer complexos de proteína-RNA, e, portanto, deve dar nenhum sinal sobre o gel SDS-PAGE, e nenhum produto detectável após a amplificação PCR. Alto rendimento de sequenciamento dessas bibliotecas controle deve retornar muito poucas seqüências únicas. Knockdown células não são recomendadas como um controle de sequenciamento, uma vez que as seqüências resultantes ainda correspondem a cross-link-sites da mesma proteína, que é purificada a partir de células knockdown em quantidades menores. Precauções devem ser tomadas para evitar a contaminação com produtos de PCR a partir de experiências anteriores. A melhor maneira de minimizar este problema é espacialmente separadas as etapas pré e pós-PCR. Idealmente, a análise dos produtos de PCR e todas as etapas subseqüentes devem ser realizados em uma sala separada. Além disso, cada membro do laboratório deve usar seu próprio conjunto de buffers e outros reagentes. Desta forma, as fontes de contaminação pode ser mais fácil identificar.

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Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

Para eletroforese em gel e transferência de membrana recomendamos t ele use de XCell SureLock ® Mini-Cell e XCell II ™ Blot Módulo Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), que é compatível com o uso do pré-moldado minigels diferentes que são especificadas ao longo do protocolo . O número de marcas e ordem de todos os materiais utilizados é mencionado durante o protocolo. A lista de enzimas usadas no protocolo é mostrado na tabela abaixo. <table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Catálogo # </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> A proteína Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 10001D </td><td> utilização da proteína G para o anticorpo do rato ou de cabra </td></tr><tr><td> RNase I </td><td> Ambion </td><td> AM2295 </td><td> atividade pode mudar de lote para lote </td></tr><tr><td> T4 RNA ligase I </td><td> NEB </td><td> M0204S </td><td> </td></tr><tr><td> PNK </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> </td></tr><tr><td> proteinase K </td><td> Roche </td><td> 03115828001 </td><td> </td></tr><tr><td> Sobrescrito III da transcriptase reversa </td><td> Invitrogen </td><td> 18080044 </td><td> </td></tr><tr><td> Circligase II </td><td> Epicentro </td><td> CL9021K </td><td> </td></tr><tr><td> FastDigest ® BamHI </td><td> Fermentas </td><td> FD0054 </td><td> </td></tr><tr><td> AccuPrime ™ Supermix I </td><td> Invitrogen </td><td> 12342010 </td><td> esta mistura PCR dá os melhores resultados em nossas mãos </td></tr></table>

iclip - transcriptome-wide mapping of protein-rna interactions with individual nucleotide resolution

A composição única e arranjo espacial de RNA-proteínas de ligação (RBPs) em uma transcrição orientar os diversos aspectos da pós-transcricional regra 1. Portanto, um passo essencial para a compreensão transcrição regulação a nível molecular é obter informação sobre a posição dos sítios de ligação de RBPs 2. Proteína-RNA interações podem ser estudadas através de métodos bioquímicos, mas estas abordagens não tratam RNA obrigatório em seu contexto nativo celular. Tentativas iniciais de estudo da proteína-RNA complexos no seu ambiente celular empregada purificação de afinidade ou imunoprecipitação combinado com display diferencial ou análise de microarray (RIP-CHIP) 3-5. Essas abordagens eram propensos a identificar interações indiretas ou não-fisiológicos 6. A fim de aumentar a especificidade ea resolução posicional, uma estratégia referida como CLIP (UV cross-linking e imunoprecipitação) foi introduzida 7,8. CLIP combina UV cross-linking de proteínas e moléculas de RNA com esquemas de purificação rigoroso incluindo eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida. Em combinação com as tecnologias de seqüenciamento de alto rendimento, CLIP provou como uma ferramenta poderosa para estudar a proteína-RNA interações em escala do genoma (referido como HITS CLIP CLIP-ou-seq) 9,10. Recentemente, PAR CLIP foi introduzida que usa análogos ribonucleosídeo fotorreativas de cross-linking 11,12. Apesar da alta especificidade dos dados obtidos, os experimentos CLIP muitas vezes gerar bibliotecas de cDNA de complexidade seqüência limitada. Isto é em parte devido à quantidade restrita de co-purificada RNA e os dois ineficiente reações ligadura RNA necessários para a preparação da biblioteca. Além disso, os testes indicaram que a extensão de primer cDNAs muitos truncar prematuramente no reticulado 13 nucleotídeos. Tais cDNAs truncado são perdidos durante o protocolo padrão preparação CLIP biblioteca. Recentemente, desenvolveu iCLIP (individual de nucleotídeo CLIP resolução), que capta a cDNAs truncado, substituindo um dos passos ineficientes intermolecular ligadura RNA com uma mais eficiente circularização intramolecular cDNA (Figura 1) 14. Importante, o seqüenciamento do cDNAs truncado fornece insights sobre a posição do site cross-link com resolução de nucleotídeos. Nós aplicado com sucesso para estudar iCLIP hnRNP organização partícula C em uma escala do genoma e avaliar o seu papel na regulação do splicing 14.

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iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

O arranjo espacial de RNA-proteínas que se ligam em uma transcrição é um determinante-chave de regulação pós-transcricional. Por isso, desenvolvemos individuais de nucleotídeo crosslinking UV resolução e imunoprecipitação (iCLIP) que permite o mapeamento do genoma precisa dos sítios de ligação de uma proteína RNA-binding.

iCLIP - Transcriptoma-wide Mapeamento das Interações Proteína-RNA com a Resolução Nucleotide Individual

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

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58.1K visualizações.  Medical Research Council - MRC. O arranjo espacial de RNA-proteínas que se ligam em uma transcrição é um determinante-chave de regulação pós-transcricional. Por isso, desenvolvemos individuais de nucleotídeo crosslinking UV resolução e imunoprecipitação (iCLIP) que permite o mapeamento do genoma precisa dos sítios de ligação de uma proteína RNA-binding.

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Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard cuticle which makes it difficult to use protocols of classical histology. In addition, histological sectioning destroys the sample and can therefore not be used for unique material. Hence, a non-destructive method is desirable which allows to view inside small samples without the need of sectioning.
We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (France) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows us to reconstruct the internal organization in its natural state without the artefacts produced by histological sectioning. These date can be used for quantitative morphology, landmarks, or for the visualization of animated movies to understand the structure of hidden body parts and to follow complete organ systems or tissues through the samples.

We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows the reconstruction of internal structures in their natural state without the artefacts produced by histological sectioning.

Não-invasivo 3D Visualization com Sub-micron Resolução Usando Síncrotron-X-ray-tomografia

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Biologia

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and release from individual presynaptic terminals directly, we designed fluorescent false neurotransmitters as substrates for the synaptic vesicle monoamine transporter. Using these probes to image dopamine release in the striatum, we made several observations pertinent to synaptic plasticity. We found that the fraction of synaptic vesicles releasing neurotransmitter per stimulus was dependent on the stimulus frequency. A kinetically distinct "reserve" synaptic vesicle population was not observed under these experimental conditions. A frequency-dependent heterogeneity of presynaptic terminals was revealed that was dependent in part on D2 dopamine receptors, indicating a mechanism for frequency-dependent coding of presynaptic selection.

Hui Zhang and Niko G. Gubernator contributed equally to this work.

A new means to measure neurotransmission optically using fluorescent dopamine analogs.

Liberação de dopamina no Individual Terminais Pré-Sinápticas visualizado com FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - um método para identificar em toda a Transcriptoma Sítios de Ligação de Proteínas RNA Binding

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

Cromatina Análise de Interação com Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) para mapeamento Interações cromatina e Compreensão regulação da transcrição

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

Monitoramento em tempo real de Ligante-receptor Interações com transferência de energia de ressonância de fluorescência

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent progress, the functional properties and lateralization of the human auditory cortex are far from being fully understood. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a non-invasive technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses, and represents a unique method of exploring plasticity and connectivity. It has only recently begun to be applied to understand auditory cortical function 2. 
An important issue in using TMS is that the physiological consequences of the stimulation are difficult to establish. Although many TMS studies make the implicit assumption that the area targeted by the coil is the area affected, this need not be the case, particularly for complex cognitive functions which depend on interactions across many brain regions 3. One solution to this problem is to combine TMS with functional Magnetic resonance imaging (fMRI). The idea here is that fMRI will provide an index of changes in brain activity associated with TMS. Thus, fMRI would give an independent means of assessing which areas are affected by TMS and how they are modulated 4. In addition, fMRI allows the assessment of functional connectivity, which represents a measure of the temporal coupling between distant regions. It can thus be useful not only to measure the net activity modulation induced by TMS in given locations, but also the degree to which the network properties are affected by TMS, via any observed changes in functional connectivity.
Different approaches exist to combine TMS and functional imaging according to the temporal order of the methods. Functional MRI can be applied before, during, after, or both before and after TMS. Recently, some studies interleaved TMS and fMRI in order to provide online mapping of the functional changes induced by TMS 5-7. However, this online combination has many technical problems, including the static artifacts resulting from the presence of the TMS coil in the scanner room, or the effects of TMS pulses on the process of MR image formation. But more importantly, the loud acoustic noise induced by TMS (increased compared with standard use because of the resonance of the scanner bore) and the increased TMS coil vibrations (caused by the strong mechanical forces due to the static magnetic field of the MR scanner) constitute a crucial problem when studying auditory processing. 
This is one reason why fMRI was carried out before and after TMS in the present study. Similar approaches have been used to target the motor cortex 8,9, premotor cortex 10, primary somatosensory cortex 11,12 and language-related areas 13, but so far no combined TMS-fMRI study has investigated the auditory cortex. The purpose of this article is to provide details concerning the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools to investigate auditory processing. 
Previously we showed that repetitive TMS (rTMS) at high and low frequencies (resp. 10 Hz and 1 Hz) applied over the auditory cortex modulated response time (RT) in a melody discrimination task 2. We also showed that RT modulation was correlated with functional connectivity in the auditory network assessed using fMRI: the higher the functional connectivity between left and right auditory cortices during task performance, the higher the facilitatory effect (i.e. decreased RT) observed with rTMS. However those findings were mainly correlational, as fMRI was performed before rTMS. Here, fMRI was carried out before and immediately after TMS to provide direct measures of the functional organization of the auditory cortex, and more specifically of the plastic reorganization of the auditory neural network occurring after the neural intervention provided by TMS. 
Combined fMRI and TMS applied over the auditory cortex should enable a better understanding of brain mechanisms of auditory processing, providing physiological information about functional effects of TMS. This knowledge could be useful for many cognitive neuroscience applications, as well as for optimizing therapeutic applications of TMS, particularly in auditory-related disorders.

Auditory processing is the basis of speech and music-related processing. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) has been used successfully to study cognitive, sensory and motor systems but has rarely been applied to audition. Here we investigated TMS combined with functional Magnetic Resonance Imaging to understand the functional organization of auditory cortex.

Mapear as sequelas de Theta Explosão Estimulação no córtex auditivo humano com Imagem Funcional

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

Mapeamento de todo o genoma de DNA Interações medicamentosas-em células com COSMIC (reticulação de moléculas pequenas para isolar Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-seq: Genoma-wide Mapeamento das Interações Proteína-DNA por High Throughput Sequencing de fragmentos de DNA metilado-Adenina

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.