Agradecemos a J. Chen para fornecer o protocolo de síntese enjaulado fluoresceína-dextran. Esta pesquisa foi suportada pelo March of Dimes prêmio 5-AF09-78, a American Heart Association 09BGIA2090075 prêmio, eo prêmio NIH / NHLBI HL107369 R01-01 a SS Um agradecimento especial a C. Closson por sua assistência microscopia.

1. Síntese de fluoresceína enjaulado-dextran (adaptado de Ref. 14) <ol><li> Prepare uma solução 0,1 M de borato de sódio diluído em DDH 2 O. </li><li> Medida 4 mg de 10 kDa aminodextran e adicioná-lo ao tubo de fluoresceína CMNB-enjaulado. </li><li> Adicionar 500 mL da solução preparada borato de sódio (passo 1.1) para o tubo de fluoresceína CMNB-enjaulado. Tampe o tubo e vortex por 30 segundos para dissolver a mistura. </li><li> Deixe a mistura reage durante a noite em um nutator à temperatura ambiente. Cobrir o tubo com papel alumínio para evitar a exposição da mistura a luz ambiente. </li><li> Obter uma coluna de spin Zeba dessalinizar e retire a tampa inferior. Marca um ponto na coluna, que será utilizado para orientar a coluna quando centrifugação. Coloque a coluna em um tubo cônico de 15ml Falcon. Nota: A solução na coluna spin é tampão coluna. </li><li> Solte a tampa superior na coluna de spin desalt. Coloque o tubo de 15 mL cônico Falcon que abriga a coluna de spin desalt em uma centrífuga. Orientar a coluna de rotação com o ponto marcado (passo 1.4) de frente para o centro do rotor de centrífuga. Centrifugar o tubo a 1000 xg por 2 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Após a centrifugação, remover a coluna girar desalt do tubo Falcon. Descartar tanto o fluxo coletados através eo tubo cônico de 15 mL. Obter um novo tubo de 15 mL cônico Falcon, e colocar a coluna girar desalt no tubo Falcon novo. Nota: Depois da centrifugação, o leito de resina coluna deve aparecer compactado. Use a coluna imediatamente. </li><li> Obter a mistura reagiu (Caged fluoresceína-dextran) no passo 1.3. Remova a tampa da coluna de girar e aspirar a mistura reage e aplicá-lo lentamente para o centro da coluna de spin desalt. Depois de aplicar a mistura reagiu, recoloque a tampa na coluna de spin. </li><li> Colocar o tubo Falcon, que abriga a coluna de spin desalt em uma centrífuga. Como foi feito no passo 1.5, orientar a coluna de spin com o ponto marcado em frente ao centro do rotor de centrífuga. Centrifugar o tubo a 1000 xg por 2 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Após a centrifugação, uma mistura amarelo (enjaulado fluoresceína-dextran) serão coletados (aproximadamente 400 mL) nos 15 tubos Falcon mL. Transfira a mistura fluoresceína enjaulado-dextran a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. </li><li> Cobrir imediatamente o tubo com papel alumínio para evitar a exposição da mistura a luz ambiente. Lyophilize o enjaulado mistura fluoresceína-dextran em um speedvac. Liofilização de 350 mL deve demorar cerca de 4 horas. </li><li> Após a liofilização completa, ressuspender o pó (cerca de 3 mg) no DDH 2 O para uma concentração final de aproximadamente 1% w / v. Mix por breves instantes, vórtex de suspender o pó. </li><li> Alíquota da gaiola de fluoresceína-dextran em tubos de metal separadas folha coberto, e armazená-los a -20 ° C. </li></ol> 2. Colheita de embriões e da microinjeção enjaulado fluoresceína-dextran * Este procedimento usa o peixe-zebra como o sistema modelo animal. <ol><li> No dia antes de injecções, criada cruza zebrafish de 1:1 do sexo masculino para feminino ou masculino 02:01 para o feminino na criação de tanques com divisórias. </li><li> Na manhã seguinte, trocar a água do tanque de reprodução e remover os divisores. Imediatamente preparar a 5 mL 10/01 solução diluída de trabalho de gaiola de fluoresceína-dextran em qualquer 1 X Danieau media (ver Preparação de Soluções) ou DDH 2 O. Cobrir o tubo de solução de trabalho com papel alumínio para evitar a exposição à luz. </li><li> Pipeta preparada enjaulado solução fluoresceína-dextran (passo 2.2) para a agulha. Antes de cortar a ponta da agulha com um tamanho adequado sob o microscópio de dissecação, coloque um pedaço de filtro amarelo transparente em frente à fonte de luz branca. O filtro amarelo vai impedir uncaging espontânea da fluoresceína-dextran durante as injeções. Ao olhar através da ocular ocular, a fonte de luz deve aparecer amarela. </li><li> Coletar embriões e pipeta-los em uma bandeja de molde microinjeção. Definir o tempo de microinjeção para entregar 3-4 nL de gaiola de fluoresceína-dextran. Sob o microscópio de dissecação, orientar os embriões com uma pinça e injetar (3-4 nL) enjaulado fluoresceína-dextran na base das células blastômero (blastômero-gema de interface). A fase de embrião para a injecção deve ser 1 - a 2 células de palco. </li><li> Após a injeção, remova os embriões a partir da bandeja do molde microinjeção e colocá-los numa placa de Petri contendo água limpa peixe fresco. Azul de metileno pode ser adicionado à água de peixe para evitar crescimento de fungos na concentração final de pelo menos 0,02% w / v. Cobrir a placa de Petri com papel alumínio para evitar uncaging da injecção de gaiola de fluoresceína-dextran. </li><li> Levantar os embriões injetado para uma fase em que as células de interesse precisam ser fotoativado. Para fotoativação, prepare uma baixa temperatura de fusão de 0,6% em solução de agarose DDH 2 O. Dependendo da fase de embrião, tricaina (MS222) pode ser adicionado à baixa temperatura de fusão de agarose. Para fazer isso, diluir 0,02% tricaina em baixa temperatura de fusão agarose a uma concentração final de 0,0014%. </li><li> Assim que os embriões atingem o estágio adequado de desenvolvimento, os embriões dechorionate em 1 X Danieau mídia com uma pinça. Quando dechorionating, certifique-se que um filtro amarelo transparente é colocado no caminho da fonte de luz branca (veja o passo 2.3). </li><li> Aqueça a 0,6% baixa temperatura de fusão solução de agarose a 37 ° C. Pipetar 1 mL de baixa temperatura de fusão agarose no poço de um slide lamela LabTek câmaras. Cuidadosamente montagem 3-4 embriões em baixa temperatura de fusão agarose e orientá-los com uma pinça com as células a serem fotoativados voltado para baixo contra a lamela inferior. </li><li> Permitir que a agarose para solidificar. Após a solidificação, pipetar 1 mL de 1 X Danieau mídia sobre o agarose. </li><li> Repita os passos de 2,8-2,9 para mais embriões. </li></ol> 3. Dois fótons ativação de gaiola de fluoresceína-dextran * Este procedimento pressupõe que o embrião expressa GFP repórter. O embrião é visto usando o íon de argônio (488 nm) fonte de laser ligado ao microscópio LSM 510 META NLO. Uma célula GFP único positivo é selecionado e fotoativado com o Mai Tai laser (laser de femtossegundos) acoplado ao LSM 510. O procedimento é o mesmo para os não-fluorescentes embriões. Alternativamente, a luz branca pode ser usada para encontrar a célula a ser ativado, seguida de ativação usando o Mai Tai fonte de laser. <ol><li> Carregue o LSM 510 software. Colocar um filtro transparente amarelo no caminho de luz branca feixe. </li><li> Selecione Digitalizar nova imagem e clique em Iniciar Expert Mode. </li><li> Selecione a guia a laser. Ligue o íon argônio (488 nm) e Tai Mai (femtossegundos) fontes de laser. </li><li> Definir o Mai Tai comprimento de onda a 740 nm. </li><li> Selecione a guia de configuração. Definir a configuração do caminho óptico para o íon argônio e Tai Mai laser. </li><li> Selecione a guia Scan. Alterar o objetivo de 20X/0.8. </li><li> Definir a velocidade do scan max clicando Max. </li><li> Modo de Ajuste, Método e Número de linha, média, e 1. </li><li> Sob a aba Canais desmarque todas as fontes de laser com exceção do Tai Mai. </li><li> Coloque um medidor de energia no caminho do feixe óptico. </li><li> Selecione o botão para ativar Cont digitalização contínua. </li><li> Ajustar a transmissão% até o medidor de potência lê uma potência do laser média de 47 mW. </li><li> Interromper a verificação, selecionando o botão Parar. </li><li> Sob a guia Canais desmarque a Mai Tai fonte de laser e selecione o íon argônio (488 nm). </li><li> Selecione o botão xy Fast. Sob a guia Canais ajustar o pinhole, ganho de detector, amplificador de offset, e ganho do amplificador para o íon laser de argônio para alcançar a melhor qualidade de imagem. </li><li> Usando o controlador de estágio, encontrar e foco na célula para ativar. </li><li> Clique no botão Stop. </li><li> Usando o zoom ferramenta de zoom, em na célula ativada até que o fator de zoom na aba Modo exibe 50-70. </li><li> Interromper a verificação, selecionando o botão Parar. </li><li> Sob a aba Canais desmarque a argon ion laser (488 nm) e selecione o Mai Tai laser. </li><li> Sob a aba Modo de definir a velocidade de digitalização para 31,46 seg. </li><li> Selecione o botão único para iniciar a verificação de dois fótons ativação de gaiola de fluoresceína-dextran da célula selecionada. </li><li> Após a ativação, desmarque a Mai Tai laser sob a aba Channels e selecione novamente o argon ion laser (488 nm). </li><li> Definir o fator de zoom no modo para um, e clique no botão Max sob o título de velocidade para definir a velocidade mais rápida varredura. </li><li> Selecione xy Rápido para analisar a região fotoativados. Verificar que a região não é a laser fotoativados ablated. Para mais informações sobre ablação a laser, por favor consulte a seção de discussão. </li><li> Repita os passos acima para outros embriões. </li></ol> 4. Imunodetecção de uncaged fluoresceína-dextran (adaptado de Ref. 16) <ol><li> Depois photoativation, coloque um filtro amarelo transparente na frente da fonte de luz branca e remover manualmente cada embrião da baixa temperatura de fusão agarose usando uma pinça afiada. Coloque todos os embriões removidos em uma placa de petri contendo novas frescas 1 X Danieau mídia. Cobrir a placa de Petri com papel alumínio para evitar a exposição dos embriões à luz. </li><li> Se necessário, os embriões traseira para o estágio de desenvolvimento desejado. Nesse meio tempo, prepare uma solução de paraformaldeído a 4% (ver Preparação de Soluções). Alíquota de 1,5 mL de paraformaldeído preparado em um tubo de microcentrífuga. </li><li> Depois os embriões atingiram o estágio de desenvolvimento de interesse, pipetar os embriões dentro do tubo de microcentrífuga (a partir do passo 4.2). Cobrir o tubo com papel alumínio para evitar a exposição à luz. </li><li> Nutar do tubo durante a noite a 4 ° C. Para o dia seguinte prepare classificados etanol (EtOH) soluções em tampão fosfato salina (PBS) e 2 DDH O; 30% EtOH: PBS, EtOH 50%: PBS, EtOH 70%: DDH 2 O, e 100% EtOH. </li><li> No dia seguinte, retire os embriões a partir de 4 ° C. Remova o papel alumínio que cobre o tubo e aspirar rapidamente off parágrafoformaldehye (deixar para trás um pequeno volume que é suficiente para cobrir os embriões). Pipetar 1,5 mL de EtOH 30%: PBS dentro do tubo. Re-cobrir o tubo com papel alumínio. Nutar o tubo à temperatura ambiente por 10 minutos. </li><li> Repita o passo 4.5 usando 50, 70 e 100% classificados soluções EtOH. Após a lavagem EtOH 100%, lavar os embriões de novo em EtOH 100% para 10 mins. </li><li> Após as lavagens, armazenar os embriões durante a noite a -20 ° C. Para o dia seguinte preparar tampão fosfato tween (PBT; ver Preparação de Soluções), 5 X tampão de bloqueio (ver protocolo do fabricante para a preparação), ácido maleico (protocolo para a preparação pode ser encontrado no protocolo de tampão de bloqueio), 10 mg / ml proteinase K, e uma solução de 10 X anticorpo (Anti-fluoresceína-AP; ver Preparação de Soluções). </li><li> Também preparam a 2% de soro de carneiro (LS; ver Preparação de Soluções) diluída em PBT. Armazenar os anticorpos a 4 ° C durante a noite em um tremendo nutator. O LS 2% pode ser mantido a 4 ° C. </li><li> No dia seguinte, retire os embriões de -20 ° C. Remova o papel alumínio que cobre o tubo e aspirar rapidamente fora de 100% EtOH. Adicionar 1,5 mL de EtOH 70%: 2 O DDH ao tubo. Re-cobrir o tubo com papel alumínio. Nutar o tubo à temperatura ambiente por 10 minutos. </li><li> Repita o passo 4,8 com 50 e 30% EtOH soluções graduais e PBT de 100%. Após a lavagem PBT 100%, lavar os embriões vezes 3 mais em PBT 100% para 10 mins. </li><li> Se os embriões são mais de 24 horas, proteinase K tratá-los. Se não, vá para o passo 4.13. Para fazer isso, dilua o preparado proteinase K (passo 4.7) 1:1000 em PBT. Incubar os embriões em proteinase K por 10 minutos ou mais, se os embriões são mais velhos. Manter os embriões coberto de uma camada de metal para evitar a exposição à luz. </li><li> Após tratamento proteinase K, lave os embriões 5 vezes em PBT de 10 minutos. Após a lavagem, fixar os embriões em paraformaldeído 4% por 30 minutos à temperatura ambiente em um nutator. Depois, lave imediatamente os embriões 5 vezes em PBT de 10 minutos. Manter os embriões coberto de uma camada de metal para evitar a exposição à luz. </li><li> Faça tampão de bloqueio, diluindo 5 X tampão de bloqueio no tampão de ácido maleico a 1 X. Remova os embriões de PBT e colocá-los em um buffer de X bloqueio. Cobrir os embriões com folha de metal e nutar-los em temperatura ambiente por 5-6 horas. </li><li> Depois de 5-6 horas de choque térmico de bloqueio, os embriões a 65 ° C por 15 a 20 minutos. </li><li> Obter a solução de anticorpos ea LS 2% preparado no dia anterior. Centrifugar a solução de anticorpos no máximo rpm. Transferir a fase aquosa para o tubo de LS 2%. Inverter o tubo para misturar. </li><li> Transferir os embriões de tampão de bloqueio à mistura LS-anticorpo. Manter os embriões coberto de uma camada de metal para evitar a exposição à luz. Nutar os embriões a 4 ° C durante a noite. </li><li> No dia seguinte, lave os embriões à temperatura ambiente 6 vezes durante 15 minutos em PBT. Prepare AP buffer (ver Preparação de Soluções). </li><li> Lavar os embriões em temperatura ambiente 2 vezes por 10 minutos em tampão AP. Prepare NBT / BCIP solução em desenvolvimento (ver Preparação de Soluções). </li><li> Transferir os embriões para NBT / BCIP. Permitir que a mancha de desenvolver no escuro. </li><li> Parar o desenvolvimento dos embriões por lavagem 3 vezes em PBT por 5 minutos cada. </li><li> Para aquisição de imagem montar a embriões em 0,6% agarose baixa temperatura de fusão ou metilcelulose 3%, e adquirir imagens através de um microscópio composto invertido ou vertical. </li><li> Fotoativados amostras podem ser armazenadas para futuras análises (coloração permanece estável) por desidratação-los em uma lavagem de EtOH classificados. Siga os passos de 4,4 por 4,7 para desidratar as amostras. </li></ol> 5. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/3172/3172fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Fotoativação do Caged fluoresceína-dextran. (A, B) Brightfield e imagem da fluorescência de um embrião de peixe-zebra vista lateral na fase 13/14-somite antes de fotoativação. (C, D) O embrião foi fotoativado na fase the13/14-somite em um dos somitos (seta) com um comprimento de onda de 740 nm, tempo de varredura de 31 segundos, e uma potência de laser média de 47 mW. Pós-ativação, (d) de fluorescência de uncaged fluoresceína-dextran é observado. Orientação: Dorsal (direita), ventral (à esquerda). Barra de escala 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/3172/3172fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Imunodetecção de gaiola de fluoresceína-dextran. A Figura 2 mostra a imunocoloração de uncaged fluoresceína-dextran em um embrião de peixe-zebra 18/19 hpf. Na fase de 10 somito uma pequena região do embrião foi ativado no mesoderma da placa lateral usando os parâmetros do laser mesmo declarou na Figura 1. Utilizando o procedimento de imunodetecção, a seta identifica a região ativada com coloração de fundo mínimo. Orientação: Dorsal (top), ventral (inferior). Barra de escala 100 mm.

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Não há conflitos de interesse declarados.

<html> Este artigo descreve um método versátil para mapeamento única célula destino baseado na fotoativação de gaiola de fluoresceína-dextran. Uncaging de fluoresceína-dextran enjaulado em uma única célula é obtida através de dois fótons de absorção de um laser de femtossegundos Mai Tai acoplada ao microscópio Zeiss LSM 510 META confocal. Uncaged fluoresceína-dextran em células fotoativados é rapidamente visualizada através de um procedimento simples imuno-histoquímica. Neste protocolo o comprimento de onda de absorção de dois fótons para fotoativação de gaiola de fluoresceína-dextran é 740 nm. Este comprimento de onda foi determinado experimentalmente por photoactivating enjaulado fluoresceína-dextran embriões tipo selvagem injetado. O comprimento de onda de excitação do laser foi variado 600-800 nm, ea presença ou ausência de fluoresceína de fluorescência de pós-ativação foi qualitativamente determinado. Nós descobrimos que 740 nm produziu a ativação de sinal mais forte de fluoresceína seguinte. Idealmente, 740 nm deve funcionar para todos os sistemas do modelo, no entanto, aconselhamos testar uma gama de comprimentos de onda para determinar o comprimento de onda de excitação ideal de dois fótons de sua amostra. Em gaiolas de fluoresceína-dextran embriões tipo selvagem injetado, para cada comprimento de onda de excitação de dois fotões testado também variadas a potência do laser média. Para um comprimento de onda de excitação de 740 nm, uma potência do laser média de 47 mW produziu um sinal mais forte de fluoresceína na região ativada em comparação com menores poderes a laser média. Maior poder de laser média não produzem sinais mais fortes de fluoresceína, mas a ablação induzida do tecido. Desde pulsos de laser de femtossegundos são eficientes na ablação de tecido biológico 15, recomendamos determinação do limiar de potência do laser média de fotoativação que evita a ablação de tecido. Dois fótons absorção ocorre dentro de um volume pequeno de interação. Para garantir a activação correcta de gaiola de fluoresceína-dextran, a célula deve ser trazida para o foco correto. No protocolo acima, as células GFP positivas foram simultaneamente fotografada sob luz branca para confirmar o foco da célula. Portanto, a aquisição de luz branca, além de outros canais é aconselhável. Após a confirmação de foco de células, nosso protocolo sugere ampliação da célula ativada. Um fator de zoom de 50 a 70 é sugerido, no entanto, este valor depende do tamanho da célula escolhida. Aumentar o zoom isola a célula ativada a partir de células adjacentes, e limita a área de digitalização de dois fótons ativação. Idealmente, a área de digitalização deve cobrir uma grande área da célula. Detecção de células ativadas único requer que a coloração de fundo ser mínima. No protocolo imunodetecção acima, é importante que a amostra está bloqueada em tampão de bloqueio por 5 a 6 horas (passo 4.13). Ao desenvolver com NBT / BCIP, uncaged fluoresceína-dextran deve tornar-se visíveis em 10 a 20 minutos. Se é forte coloração de fundo, sugerimos um maior tempo de bloqueio e lavagens adicionais para remover os anticorpos (passo 4.17). Figuras 1 e 2 fornecem resultados representativos de fotoativação e imunodetecção. Na Figura 1, os primeiros 1 - a 2 células de embriões tipo selvagem fase foram injetados com gaiola de fluoresceína-dextran. Os embriões foram criados para somitogenesis médio e montado em baixa temperatura de fusão agarose na orientação lateral. Figura 1 (a, b) mostram claro e imagens fluorescentes do embrião antes de fotoativação. Evidência de que o embrião permaneceu uncaged é demonstrado pela ausência de fluorescência da fluoresceína na Figura 1 (b). Uma pequena região dentro de um somito foi ativado com um comprimento de onda de 740 nm por 31 segundos usando um laser de potência média de 47 mW, a Figura 1 (c; seta). Pós-ativação, uncaging dois fótons de fluoresceína-dextran ocorreu como mostra a fluorescência da área ativada, Figura 1 (d; seta). Ativação não foi acompanhada por ablação a laser, como o tecido somítica permaneceu Figura, intacta 1 (c). Figura 2 demonstra a imunodetecção de uncaged fluoresceína-dextran. Uma pequena região no mesoderma da placa lateral de um embrião de estágio de 10 somito foi fotoativado usando os parâmetros do laser mesmo, como mencionado na Figura 1. O embrião foi criado e processado utilizando os passos 4.1 até 4.20. A seta na Figura 2 localiza a região ativada, como indicado pelo acúmulo de precipitado azul. Apenas a localização ativado é claramente detectado sem interferir coloração de fundo. Preparação das soluções: 1 X PBT (1 L) 100 mL 10 X PBS 2 g BSA 10 mL de Tween 20% 10 X PBS (1 L) 80 g de NaCl 2 g KCl 6,1 g Na 2 HPO 4 1,9 g KH 2 PO 4 DDH 2 O em 1 L pH para 7,3 Paraformaldeído 4% (160 mL) Paraformaldeído 32% (dois frascos de 10 mL) 8 mL 20 X PBS 132 mL DDH 2 O jove_content &quot;&gt; AP Tampão (50 mL) 1 mL de NaCl 5 M 2,5 ml 1 M MgCl 2 5 mL 1 M Tris pH 9,5 250 mL de Tween 20% 41,25 mL DDH 2 O Solução de anticorpos (para 1 amostra) 5,5 mL de acetona em pó 40 mL PBT 0,8 mL LS 0,1 de anticorpos Anti-fluoresceína-AP mL LS 2% (360 mL de uma amostra) 7,2 mL LS 100% 352,8 mL PBT 1 X Danieau media (1 L) ‡ 11,6 mL de NaCl 5 M 700 mL KCl 1 M 400 mL 1 M MgSO 4 600 mL 1 M Ca (NO 3) 2 5 mL 1 M HEPES DDH 2 O em 1 L pH ajustar para 7,6 ‡ Danieau é uma solução de sal ideal para a criação de embriões zebrafish dechorionated. Outros meios de comunicação podem ser usados, desde que sejam corretamente com soluções isotônicas osmolaridade (mOsm ~ 300 para zebrafish) NBT estoque (1 mL) 50 mg Nitro Blue Tetrazolium 0,7 mL de anidrido dimetil formamida 0,3 mL DDH 2 O BCIP estoque (1 mL) 50 mg 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato 1 mL de anidrido dimetil formamida NBT / BCIP solução desenvolvimento 1 mL tampão AP 4,5 mL NBT estoque 3,5 mL de ações BCIP Pó de acetona <ol><li> Selecione 20 peixes adultos e congelá-los em nitrogênio líquido. </li><li> Moer o peixe congelado com um almofariz e pilão de um pó. </li><li> Transferir o pó de peixe em um tubo cônico de 50 mL. </li><li> Encha o tubo cônico com acetona 100%. Vortex do tubo. </li><li> Girar o tubo no máximo rpm por 10 minutos. Desprezar o sobrenadante. </li><li> Lavar o pellet de mais 3 vezes em acetona 100% e girar o tubo no máximo rpm por 10 minutos. Pela última lavagem, o sobrenadante deve aparecer claro. </li><li> Adicionar 100% de acetona para a pelota de novo e deixar o tubo repousar à temperatura ambiente. As partículas mais densas vai resolver, enquanto as partículas mais finas permanecem em suspensão. </li><li> Decantar as partículas finas em um novo tubo. Solução alíquota do pó em tubos separados e armazená-los a -20 ° C. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> CMNB gaiolas fluoresceína SE </td><td> Invitrogen </td><td> C20050 </td></tr><tr><td> 10 kDa Aminodextran </td><td> Invitrogen </td><td> D1860 </td></tr><tr><td> Zeba Coluna Giro dessalinizar </td><td> Perfurar </td><td> 89889 </td></tr><tr><td> Baixa temperatura de fusão agarose </td><td> Amresco </td><td> 0815-100G </td></tr><tr><td> Borato de sódio </td><td> Amresco </td><td> 1131117-100G </td></tr><tr><td> Tricaina Methylsulfonate / MS222 </td><td> Organics pesquisa </td><td> 1347A </td></tr><tr><td> Anti-fluoresceína-AP </td><td> Roche </td><td> 11376622 </td></tr><tr><td> Tampão de bloqueio </td><td> Roche Applied Sciences </td><td> 11 096 176 001 </td></tr><tr><td> Ácido maleico </td><td> Sigma </td><td> MO375-500G </td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Microscopia Eletrônica de Ciências </td><td> 15714 </td></tr><tr><td> NBT </td><td> Sigma </td><td> I8377-250mg </td></tr><tr><td> BCIP </td><td> Fischer Scientific </td><td> PI-34040 </td></tr><tr><td> Microinjetor </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PLI-2000 </td></tr><tr><td> LabTek câmaras lamela slides </td><td> Nalge Nunc Internacional </td><td> 155380 </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Invitrogen </td><td> AM2544 </td></tr><tr><td> Cordeiro de soro </td><td> Invitrogen </td><td> 16070096 </td></tr><tr><td> LSM 510 META NLO </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> 20X 0,8 NA Air apocromático objetivo </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Filtro amarelo transparente </td><td> Theatre House Inc. </td><td> Roscolux Cor folha de filtro: 312 </td></tr></tbody></table>

single cell fate mapping in zebrafish

A capacidade de uma única célula diferencialmente rótulo tem implicações importantes na biologia do desenvolvimento. Por exemplo, determinar como hematopoiético, as linhagens de vasos linfáticos e sanguíneos surgem em embriões em desenvolvimento exige o mapeamento destino traçado e linhagem de células precursoras indiferenciadas. Recentemente, proteínas photoactivatable que incluem: Eos 1, 2, 3 PAmCherry, Kaede 4-7, pKindling 8, e KikGR 9, 10 receberam grande interesse como sondas celular de rastreamento. O espectro de fluorescência destas proteínas fotossensíveis podem ser facilmente convertidos com excitação UV, permitindo uma população de células para ser distinguido de outras adjacentes. No entanto, a foto-da proteína ativada pode limitar a longo prazo de células de rastreamento 11. Como uma alternativa às proteínas photoactivatable, enjaulado fluoresceína-dextran tem sido amplamente utilizado em sistemas de embrião modelo 7, 12-14. Tradicionalmente, para libertar da gaiola de fluoresceína-dextran, excitação UV de uma casa de lâmpada fluorescente ou um laser UV de fóton único tem sido usada, no entanto, tais fontes limitar a resolução espacial de fotoativação. Aqui nós relatamos um protocolo para mapear o destino, traçar a linhagem, e detectar única células marcadas. Células individuais de embriões injetados com enjaulado fluoresceína dextran são fotoativados com pulsos de laser infravermelho próximo produzido a partir de um laser de femtossegundos de titânio safira. Este laser é de costume em todos os microscópios confocal de dois fótons, como o LSM 510 META NLO microscópio utilizado neste trabalho. Como o tecido biológico é transparente ao infravermelho próximo irradiação 15, os pulsos de laser pode ser focalizado no fundo do embrião sem uncaging células acima ou abaixo do plano selecionado focal. Portanto, não-linear de absorção de dois fótons é induzido apenas no foco geométrico para libertar da gaiola de fluoresceína-dextran em uma única célula. Para detectar a célula que contém uncaged fluoresceína-dextran, nós descrevemos um protocolo de imuno-histoquímica simples 16 a rapidamente visualizar a célula ativada. O protocolo de ativação e de detecção apresentado neste artigo é versátil e pode ser aplicado a qualquer sistema modelo. Nota: Os reagentes utilizados neste protocolo pode ser encontrado na tabela anexada ao final do artigo.

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Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

Um método é descrito para photoactivate células individuais contendo uma proteína fluorescente enjaulado usando absorção de dois fótons de uma Ti: Sapphire oscilador laser de femtossegundos. Para mapear o destino da célula fotoativados, imuno-histoquímica é usada. Esta técnica pode ser aplicada a qualquer tipo de célula.

Mapeamento Destino única célula em Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K visualizações.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Um método é descrito para photoactivate células individuais contendo uma proteína fluorescente enjaulado usando absorção de dois fótons de uma Ti: Sapphire oscilador laser de femtossegundos. Para mapear o destino da célula fotoativados, imuno-histoquímica é usada. Esta técnica pode ser aplicada a qualquer tipo de célula.

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Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Transplante de Medula Renal inteiro em Zebrafish Adulto

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biologia

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Gravações de uma única célula de sucção de cones fotorreceptores rato

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

Uma Abordagem Prática para mapeamento genético induzível Fate: Um Guia Visual para Mark e Track Células In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Mapeamento de destino de células estaminais embrionárias humanas por formação de teratomas

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

Na eletroporação in vivo de Morpholinos no Adulto Regeneração Zebrafish Cauda Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Explantes blastômero para testar Compromisso destino celular durante o desenvolvimento embrionário

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

Geração de Disperso Presomitic mesoderme culturas de células for Imaging da Segmentação Relógio Zebrafish em células individuais

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ability to proliferate or they can differentiate and fuse into multinucleated myotubes, which maturate further to form myofibers. Skeletal muscle terminal differentiation is orchestrated by the coordinated action of various transcription factors, in particular the members of the Muscle Regulatory Factors or MRFs (MyoD, Myogenin, Myf5, and MRF4), also called the myogenic bHLH transcription factors family. These factors cooperate with chromatin-remodeling complexes within elaborate transcriptional regulatory network to achieve skeletal myogenesis. In this, MyoD is considered the master myogenic transcription factor in triggering muscle terminal differentiation. This notion is strengthened by the ability of MyoD to convert non-muscle cells into skeletal muscle cells. Here we describe an approach used to identify MyoD protein partners in an exhaustive manner in order to elucidate the different factors involved in skeletal muscle terminal differentiation. The long-term aim is to understand the epigenetic mechanisms involved in the regulation of skeletal muscle genes, i.e., MyoD targets. MyoD partners are identified by using Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) from a heterologous system coupled to mass spectrometry (MS) characterization, followed by validation of the role of relevant partners during skeletal muscle terminal differentiation. Aberrant forms of myogenic factors, or their aberrant regulation, are associated with a number of muscle disorders: congenital myasthenia, myotonic dystrophy, rhabdomyosarcoma and defects in muscle regeneration. As such, myogenic factors provide a pool of potential therapeutic targets in muscle disorders, both with regard to mechanisms that cause disease itself and regenerative mechanisms that can improve disease treatment. Thus, the detailed understanding of the intermolecular interactions and the genetic programs controlled by the myogenic factors is essential for the rational design of efficient therapies.

MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.

Identificação de MyoD interactome Usando purificação de afinidade em tandem Acoplado a Espectrometria de Massa

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Análise de partícula única open-source para Microscopia Super-resolução com VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...