Este projeto foi financiado pelo Departamento de Saúde Pública de Illinois eo National Science Foundation (DBI-0852416).

1. Função do dispositivo <ol><li> O dispositivo de inserção hipóxico contém seis pilares que se aninham em uma placa de 6 bem-padrão. Gás passa para o pilar, através de uma rede de microfluídica na base do pilar, e flui de volta para fora do dispositivo. Na base do pilar formando a parede inferior do microcanais é de 100 mm de espessura gás-permeáveis ​​membrana PDMS que permite a difusão de oxigênio entre o gás de microcanais e os meios de cultura. Assim, o dispositivo funciona através da criação de um gradiente de concentração que leva a concentração de oxigênio de mídia para um valor desejado. </li><li> O dispositivo oferece uma série de vantagens sobre a câmara de hipóxia e outros sistemas de oxigenação das células: 1) minimiza o caminho de difusão de oxigênio que permite controlar mais rápido temporal, 2) melhora o controle espacial sobre a oxigenação, como dependente do projeto pilar de microcanais, 3) possui um menor consumo de laboratório e um maior rendimento para aumentar a eficiência experimental, e 4) adapta-se às ferramentas de células comuns da cultura (por exemplo, com vários poços da placa) sem a exigência de conhecimento especializado e equipamentos. </li></ol> 2. Fabricação de dispositivos <ol><li> Primeiro pilar é a matriz réplica moldado com PDMS em um molde Delran previamente usinadas. </li><li> Em seguida, o gás de microcanais na parte inferior de cada pilar é fabricado usando o padrão SU-8 fotolitografia e PDMS moldagem réplica. </li><li> O gás-permeáveis ​​membrana é fabricada por fiação definido de PDMS em um wafer de silício para atingir a espessura desejada. Neste exemplo usamos uma membrana M 100 de espessura, que foi fabricado por fiação 500 rpm por 10 segundos e, em seguida, 900 rpm por 30 segundos. </li><li> Todos os componentes são ligados entre si de oxigênio após o tratamento de plasma com um dispositivo de plasma portátil (modelo BD-20, Electro-Technic Produtos). </li></ol> 3. Configuração do dispositivo <ol><li> Insira cuidadosamente dispositivo na placa, certificando-se para evitar bolhas. Dobrar o dispositivo durante a inserção ajuda a expelir bolhas para fora um lado. Para reais baseados em células experimentos, esta etapa deve ser feito dentro de uma capa de fluxo laminar estéril. As chances de contaminação são muito reduzidas uma vez que o dispositivo é inserido, de modo que o conjunto pode ser transportados para a incubadora em um ambiente não-estéril. </li><li> Conectar mangueira do tanque de gás de origem para as portas de entrada e saída do dispositivo. Para celular baseado em experimentos, a incubadora cultura deve ter um furo para permitir a entrada a tubulação e os tubos devem ser ligados, após o cumprimento do dispositivo e colocá-lo na incubadora. Ter cuidado para evitar uma pressão excessiva sobre o dispositivo, o que pode deformar o PDMS suficiente para esmagar as células subjacentes. </li><li> Verifique se o regulador de fluxo de precisão está fechado antes de abrir o regulador de alças para evitar transbordamento do dispositivo. Iniciar o fluxo de gás. Suavemente regulador de fluxo de precisão para abrir vazão desejada (50-100 mL / min). Assista o valor de perto durante a hora seguinte e fazer os ajustes necessários, já que a queda de pressão vai mudar enquanto o sistema equilibra, alterando a taxa de fluxo. Para evitar a formação de bolhas na mídia, reduzir a taxa de fluxo para entre 10-20 mL / min, após uma duração inicial de equilíbrio de 15 minutos com a maior taxa de fluxo. </li><li> Depois desejado duração experimental, fechar o gás, retire a placa, e as células processo de conformidade (por exemplo, lyse, mancha, contar, etc.) </li></ol> 4. Validação dispositivo <ol><li> Calibragem <ol><li> Selecione o número ea localização das posições sobre o oxigênio fluorescentes (FOXY) slides sensor (dependendo dos requisitos de validação) que será utilizado para a medição de oxigênio. O slide contém uma camada de corante fluorescente de rutênio que se apaga por oxigênio. </li><li> Expor slides diretamente a 0, 10 e 21% de oxigênio do tanque de gás e capturar imagens depois de 5 minutos para equilíbrio adequado. </li><li> Exportar a intensidade da imagem média para cada posição e concentração de oxigenação enredo como dependente da intensidade fluorescente. </li><li> Gerar curva de calibração por ajuste de curvas linear para a linha de 00-10% e 10-21% de linha. </li></ol></li><li> Heterogeneidade <ol><li> Estabelecer vários pontos cobrindo a largura do canal em um intervalo definido (por exemplo, a cada 1 mm). Note-se que pode haver sobreposição de imagens, dependendo do espaçamento. </li><li> Medir a concentração de oxigênio na superfície bem através do dispositivo </li></ol></li><li> Equilíbrio <ol><li> Escolha três pontos no slide FOXY em que para medir a concentração de oxigênio. </li><li> Imediatamente após a captura de uma primeira imagem em níveis de oxigênio do ambiente, abra o regulador de fluxo de precisão para iniciar o fluxo de gás para o dispositivo. Capturar imagens em um intervalo adequado para avaliar a duração ea extensão da Concentr oxigênioequilíbrio ation (por exemplo, a cada 10 segundos por 30 min). </li></ol></li></ol> 5. Aplicações <ol><li> Cicatrização de feridas <ol><li> Um dia antes do experimento, mergulhe a esterilizados inserir PDMS no soro meio livre para reduzir a inibir a formação de bolhas de gás no poço. </li><li> Células de cultura a 100% confluência em uma placa de seis poços. </li><li> Criar riscos em linha reta no monocamadas com uma ponteira p200 para simular ferimentos. </li><li> Aspirar a mídia celular, lavar com 5 mL de mídia, e aspirar novamente. É importante para não perturbar a monocamada de células. </li><li> Recarga dos poços com 4 meio isento de soro mL para reduzir a proliferação celular. </li><li> Inserir local para os poços e conectar cada poço a uma concentração de oxigênio correspondente. </li><li> Coloque placa de 6 poços com inserção no palco aquecida a 37 ° C. </li><li> Capturar imagens lapso de tempo das células no intervalo desejado e duração total. T_Scratch MATLAB, um algoritmo de medição da ferida, pode ser usado para analisar a superfície não cicatrizadas. </li></ol></li></ol> 6. Resultados representante <ol><li> Validação de dispositivos O dispositivo de inserção hipóxico apresenta grandes melhorias sobre a câmara hipóxica em termos de tempo de equilíbrio de oxigênio e extensão, necessitando de menos de 2 minutos para estabilizar a 0,5% de oxigênio. A membrana bem-dispositivo tamanho da abertura de fundo era o fator crítico na determinação da eficiência de equilíbrio, com tamanhos maiores lacuna que exigem mais tempo para atingir o estado estacionário valores de concentração de oxigênio. O dispositivo também permite que uma grande quantidade de controle sobre a oxigenação espacial em um único poço, permitindo a formação de várias condições, e até mesmo gerar um perfil cíclico de oxigênio através da superfície do poço. </li><li> Cicatrização de feridas Monocamadas de células foram expostas a 10% ou 21% de oxigênio e da superfície da ferida foi analisada ao longo do tempo. Arranhões exposto ao oxigênio 21% fechada o mais lento e 10% mais rápido. A Figura 1 mostra imagens de um zero ao longo de 17 horas. Os gráficos na Figura 5 mostram o percentual de área da ferida aberta para ambas as concentrações de oxigênio para a duração do experimento. </li></ol> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /></a> Figura 1. Esquemática e diagramas ilustrando recursos do dispositivo. O dispositivo de inserção de oxigênio é fabricado por fotolitografia convencional (rede microfluídicos), moldagem réplica (rede microfluídicos e inserir scaffold), e definiu fiação de PDMS (gás-permeáveis ​​membrana). A) O dispositivo de oxigênio aninhados em uma placa de 6 poços. B) Os exemplos de 24 e 96-matrizes pilar. C) A esquemático transversal de um pilar. Oxigênio flui para o dispositivo através da entrada e viaja através de uma rede de microfluídica na parte inferior do pilar. Oxigênio pode livremente se difundem através da membrana PDMS gás-permeáveis ​​na parte inferior da coluna e se dissolvem em meio de cultura. D) A imagem do microscópio mostrando as várias características de um pilar de canal único de cima, com mensagens de vidro coladas para os estudos de equilíbrio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /></a> Figura 2. Validação do dispositivo com sensores de oxigênio. Tensão de oxigênio dentro de cada poço foi caracterizada através de um sensor de oxigênio planar rutênio. Todas as misturas de oxigênio contendo nitrogênio equilibrada e 5% CO 2 para o buffer de mídia. A) Plot ilustrando o efeito da altura post, e distância de difusão de oxigênio, portanto, entre a membrana e células, no tempo de equilíbrio e eficácia. Alturas foram estabelecidas por pedaços de vidro de posts vinculado à parte inferior do dispositivo. Todos os três tamanhos pós rendimento vezes equilíbrio melhorou muito ao longo da câmara hipóxica. Note que o tempo está em uma escala log. B) Plot representando o rápido tempo de resposta de oxigênio equilíbrio do dispositivo gap 0,2 mm. C) A posição Multi-linescans também foram levados por todo o bem sob o microcanais para assegurar a homogeneidade da concentração de oxigênio introduzida pelo dispositivo. Gráfico mostra a concentração de oxigênio medido após a infusão de 0%, 10% e 21% de oxigênio por 10 min. D) Dispositivo efetivamente mantém 10% de oxigénio ao longo de 5 dias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" border="0" /></a> Figura 3. Experimentação com desenhos mais complexos de oxigênio de microcanais. A) instalação condição dupla de microcanais produz um 0% estável e perfil de oxigênio 21% mais de 14 dias. B) Um padrão interdigitados e sinuosa de 500 M microcanais largura se estende a toda ªresultados pilar e em um perfil de oxigênio cíclica. Observe que os dados só retrata um julgamento representante como o alinhamento de microcanais foi difícil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig5tmb.jpg" alt="Figura 4" border="0" /></a> Figura 4. Timelapse imagens de fechamento da ferida 0, 7 e 17 horas após o zero inicial. As células foram entregues 21% de oxigênio ao longo da duração do experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig6.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig6tmb.jpg" alt="Figura 5" border="0" /></a> Figura 5. Efeito da concentração de oxigênio na taxa de cicatrização de feridas em um ensaio de zero.

O dispositivo é fabricado por fotolitografia SU-8 padrão, moldagem de réplica, e definiu fiação e feito inteiramente de polidimetilsiloxano. Gás é introduzido no dispositivo para estabelecer um gradiente de concentração entre o pilar de microcanais e os meios de cultura, conduzindo o sistema para uma concentração desejada de equilíbrio de oxigênio. O dispositivo tem sido demonstrado que efetivamente modulam a oxigenação temporal e espacial dentro de um poço, bem como modular o comportamento celular de forma adequada. O padrão espacial de oxigenação é definido pelos microcanais na base do pilar, assim que uma variedade de modelos pode ser implementado na elaboração da fotomáscara. Além disso, a infusão do gás desejado na fase gasosa do poço é esperado para melhorar o tempo de equilíbrio e extensão da hipóxia. Uma rede microfluídicos mistura poderia ser adaptado para o dispositivo para fornecer um meio para produzir misturas de gases a partir de apenas um romance tanques de gás poucas ações. Finalmente, um mecanismo para troca de mídia eliminaria a necessidade de remoção do dispositivo da placa com vários poços, dos quais as células podem responder. O dispositivo tem aplicação em qualquer experimento in vitro ou ex vivo exigindo controle sobre a concentração de oxigênio. Como o oxigênio é uma importante variável fisiológica que afecta uma grande maioria das vias de sinalização, as áreas de pesquisa que se beneficiariam é limitada pela criatividade do pesquisador. Alguns campos que se beneficiaria do maior controle temporal da concentração de oxigênio incluem metástase de câncer, apnéia do sono e reperfusão cardíaca isquemia, entre muitos outros. Por exemplo, a hipóxia intermitente tem sido correlacionada com cânceres mais invasivos, upregulating uma série de metastastis genes associados em relação à hipóxia e normóxia contínua. Controle espacial também é importante, como gradientes de oxigênio são fundamentais para o desenvolvimento, zoneamento fígado, a toxicidade dos medicamentos, e os nichos de células-tronco. O dispositivo apresentado neste artigo beneficiará um número de áreas de pesquisa, fornecendo um sistema com um menor consumo de laboratório, relativamente simples requisitos operacionais e de controle muito maior sobre a exposição de oxigênio para as células.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PDMS-Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Planar FOXY sensor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ocean Optics</td>
<td>FOXY-SGS-M</td>
<td>Coated microscope slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Gas regulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega</td>
<td>FL-1472-G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gas</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Airgas</td>
<td>Custom mixes</td>
<td>All have 5% CO2</td>
</tr>
<tr>
<td>SU-8 2150</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microchem</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SAFC Biosciences</td>
<td>M3803</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>30-2020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication and operation of an oxygen insert for adherent cellular cultures 

O oxigênio é um modulador-chave de muitos caminhos celulares, mas os dispositivos atuais permitindo<em&gt; In vitro</em&gt; Modulação de oxigênio não conseguem atender às necessidades da pesquisa biomédica. A câmara hipóxica oferece um sistema simples para controlar a oxigenação em recipientes padrão, mas não tem controle temporal e espacial preciso sobre a concentração de oxigênio na superfície da célula, impedindo a sua aplicação no estudo de uma variedade de fenômenos fisiológicos. Outros sistemas têm melhorado a câmara de hipóxia, mas requerem conhecimento especializado e equipamentos para seu funcionamento, tornando-os intimidante para o pesquisador da média. Uma inserção microfabricated para placas de vários poços, foi desenvolvido para controlar mais eficazmente a concentração de oxigênio temporal e espacial de fenômenos fisiológicos melhor modelo encontrado<em&gt; In vivo</em&gt;. A plataforma consiste em uma inserção de polidimetilsiloxano que os ninhos em uma placa com vários poços padrão e serve como uma rede de gás passiva microfluídicos com uma membrana gás-permeável destinada para modular a liberação de oxigênio para células aderentes. O dispositivo é simples de usar e é conectado a cilindros de gás que proporcionam a pressão para introduzir a concentração de oxigênio na plataforma desejada. De fabricação envolve uma combinação de fotolitografia SU-8 padrão, moldagem de réplicas e PDMS definido girando em um wafer de silício. Os componentes do dispositivo são ligados após o tratamento de superfície utilizando um sistema de plasma de mão. A validação é realizada com um sensor de oxigênio planar fluorescente. Tempo de equilíbrio é da ordem de minutos e uma grande variedade de perfis de oxigênio pode ser alcançada com base no projeto de dispositivos, tais como o perfil cíclico obtido neste estudo, e até mesmo gradientes de oxigênio para imitar aqueles encontrados<em&gt; In vivo</em&gt;. O dispositivo pode ser esterilizados para cultura de células utilizando métodos comuns, sem perda de função. Aplicabilidade do dispositivo para estudar a<em&gt; In vitro</em&gt; Resposta de cicatrização será demonstrado.

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Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

Fabricação e validação de uma plataforma de add-on que oferece maior controle sobre a oxigenação espacial e temporal em uma placa de 6 poços. O dispositivo é adaptável a uma série de sistemas de cultura e pode ser usado para investigar os efeitos do oxigênio na cicatrização de feridas.

Fabricação e operação de uma inserção de oxigênio para culturas de células aderentes

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

9.6K visualizações.  University of Illinois. Fabricação e validação de uma plataforma de add-on que oferece maior controle sobre a oxigenação espacial e temporal em uma placa de 6 poços. O dispositivo é adaptável a uma série de sistemas de cultura e pode ser usado para investigar os efeitos do oxigênio na cicatrização de feridas.

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In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

Fracionamento em Subcelulares situ de aderentes e não aderentes células de mamíferos

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Biologia

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Clonogênica Ensaio: células aderentes

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Uma ferramenta analítica que quantifica Alterações morfologia celular de imagens tridimensionais de fluorescência

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Um ensaio de explante para avaliar o comportamento celular do mesênquima craniana

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Detectando, visualizar e quantificar a geração de espécies reativas de oxigênio em um modelo de sistema Amoeba

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Desenvolvimento de um Sistema Insert Co-cultura de dois tipos celulares na ausência de célula-célula Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

Um modelo In Vitro para o estudo transformação celular por Herpesvirus Sarcoma de Kaposi

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

Lente livre de microscopia para a dinâmica e a análise quantitativa de cultura de células aderentes

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen infection or challenge with pathogen-associated chemicals (pathogen-associated molecular patterns [PAMPs]), an array of immune responses, including a ROS burst, are quickly induced in plants, which is called PAMP-triggered immunity (PTI). A ROS burst is a hallmark PTI response, which is catalyzed by a group of plasma membrane-localized NADPH oxidases-the RBOH family proteins. The vast majority of ROS comprise hydrogen peroxide (H2O2), which can be easily and steadily detected by a luminol-based chemiluminescence method. Chemiluminescence is a photon-producing reaction in which luminol, or its derivative (such as L-012), undergoes a redox reaction with ROS under the action of a catalyst. This paper describes an optimized L-012-based chemiluminescence method to detect apoplast ROS production in real-time upon PAMP elicitation in rice tissues. The method is easy, steady, standardized, and highly reproducible under firmly controlled conditions.

Here, we describe a method for the real-time detection of apoplastic reactive oxygen species (ROS) production in rice tissues in pathogen-associated molecular pattern-triggered immune response. This method is simple, standardized, and generates highly reproducible results under controlled conditions.

Detecção em Tempo Real da Produção de Espécies Reativas de Oxigênio na Resposta Imune em Arroz com Ensaio de Quimioluminescência

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of conditioned media remains time-consuming and far from physiological and pathological conditions. Although a few models of co-culture are commercially available, they remain restricted to specific assays and are mostly for two types of cells. 
Here, 3D-printed inserts are used that are compatible with numerous functional assays. The insert allows the separation of one well of a 6-well plate into four compartments. A wide range of combinations can be set. Moreover, windows are designed in each wall of the compartments so that potential intercellular communication between every compartment is possible in the culture medium in a volume-dependent manner. For example, paracrine intercellular communication can be studied between four cell types in monolayer, in 3D (spheroids), or by combining both. In addition, a mix of different cell types can be seeded in the same compartment in 2D or 3D (organoids) format. The absence of a bottom in the 3D-printed inserts allows the usual culture conditions on the plate, possible coating on the plate containing the insert, and direct visualization by optical microscopy. The multiple compartments provide the possibility to collect different cell types independently or to use, in each compartment, different reagents for RNA or protein extraction. In this study, a detailed methodology is provided to use the new 3D-printed insert as a co-culture system. To demonstrate several capacities of this flexible and simple model, previously published functional assays of cell communication were performed in the new 3D-printed inserts and were demonstrated to be reproducible. The 3D-printed inserts and the conventional cell culture using conditioned media led to similar results. In conclusion, the 3D-printed insert is a simple device that can be adapted to numerous models of co-cultures with adherent cell types.

In this paper, a newly designed 3D-printed insert is presented as a model of co-culture and validated through the study of the paracrine intercellular communication between endothelial cells and keratinocytes.

Um inserto inovador impresso em 3D projetado para permitir culturas de células 2D e 3D diretas

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...