Os autores gostariam de agradecer a Lonza Walkersville por sua assistência com conhecimento em sistema fechado, design saco, empréstimo de selantes saco e soldadores, bem como a criação da bolsa de esquemas HYPERStack.

1. HYPERStack navio - Gas fundo Tecnologia de materiais permeáveis <ol><li> O navio é uma embarcação HYPERStack multicamadas para cultura de células sistema fechado que se baseia na troca de gás por meio de um gás permeável 76.2micron filme de polímero para o metabolismo celular. </li><li> O navio HYPERStack difere de mais navios de celular tradicional cultura em que ele não tem um &quot;headspace&quot; acima das células no interior do vaso. Ao invés de com este &quot;headspace&quot; para a troca de gás dentro do vaso, os produtos gás permeáveis ​​têm espaços aéreos (referido como &quot;traquéia&quot; espaços) abaixo de cada câmara de cultura que está aberto para a atmosfera. </li><li> Este espaço traqueal permite que as células crescendo em cultura de células de cada compartimento do navio para ter a troca gasosa equivalente. </li><li> O gás de película permeável permite a troca de gás para ocorrer durante a manutenção de um ambiente estéril. Todas as manipulações de fluidos para cada uma das múltiplas camadas ocorrer através de uma porta de entrada única. </li></ol> 2. HYPERStack Component Summary navio <ol><li> O Stackette é o compartimento de cultura de células individuais, que é composto de placa superior e filme gás-permeáveis. As células são cultivadas dentro desse compartimento. </li><li> O Manifold líquido conecta cada uma das 12 camadas stackette juntos dentro de um módulo HYPERStack. Módulos são conectados com tubos para formar vasos em múltiplos de 12 camadas. O colector permite ao usuário fazer uma manipulação de fluido para o navio inteiro. </li><li> O Manifold Air também conecta as camadas stackette juntos, mas usado para deslocar o ar da embarcação quando adições fluido ocorrer. Ele contém uma linha de enchimento para uso durante o enchimento. </li><li> O Espaço traqueal é o espaço ao ar livre entre cada camada stackette, permitindo a troca de gás para ocorrer através do cinema cada camadas &quot;de gás permeável. </li><li> A tubulação manipulação de líquidos é ligado ao colector de líquido e é usado para fazer todas as manipulações de fluidos sistema fechado. Este componente pode ser personalizado. </li><li> O tubo de ventilação está ligado ao colector de ar, contém um filtro de ar, e é usado para liberar o excesso de ar, mantendo a esterilidade. </li><li> A tubulação tem um filtro de perseguição e grampo e está conectado à tubulação de manipulação de líquidos e são usados ​​para evacuar o líquido da tubulação de manipulação de líquidos após o enchimento do reservatório. </li><li> O Manipulator Stack Corning ou CSM é um dispositivo de manuseio para auxiliar na colocação dos vasos na posição correta durante o uso. </li><li> O Wedge enchimento é um aço inoxidável ajudar usado quando manualmente preenchendo os vasos HYPERStack. </li></ol> 3. Resultados de gás difusão através Film gás permeável usado nos vasos HYPERStack <ol><li> Em sistemas de células tradicionais de crescimento com headspace ventiladas, o oxigênio na mídia está esgotada uma média de 50% ao longo de 3 dias em cultura. (Figura 1) </li><li> No mesmo sistema de crescimento celular, o gradiente de oxigênio em uma altura 3mm de mídia é quase 50% maior na mídia para junção headspace do que é a camada de células. (Figura 2) </li><li> A difusão de oxigênio através da película de poliestireno 76.2micron gás permeável é igual à difusão através da mídia 2,6 milímetros. O filme gás-permeáveis ​​utilizado nos vasos HYPERStack permite a troca de gás para ocorrer na camada de células. </li><li> O% de oxigênio no espaço traqueal dos vasos HYPERStack permanece constante como as células crescem à confluência. (Figura 3) </li></ol> 4. Preparação de mídia Bag <ol><li> O HYPERStack-12 navio camada leva 1.3L de media e os HYPERStack-36 navio camada leva 3.9L de media. </li><li> Antes de inocular seus meios ensacado, se o soro deve ser usado, tubo de solda a bolsa de soro para o saco da mídia e misture bem. </li><li> Grampo off aproximadamente 300 mL de mídia na bolsa usando braçadeiras grande saco. Isso irá garantir todas as células inoculadas são usadas durante o enchimento e nenhum é remanescente no saco de mídia. Coloque a mídia de saco em stand saco. </li></ol> 5. Mídia inoculação <ol><li> Encha uma seringa com tubo ligado com suspensão de células. Tubo de solda 16/03 tubos &quot;de uma seringa contendo suspensão de células para o saco de mídia. </li><li> Injetar a suspensão de células para a Bolsa de mídia e misture bem. </li></ol> 6. Preencha Procedimento <ol><li> Tubo de soldar o inoculados saco de mídia para o navio HYPERStack de 3 / 8 &quot;tubulação de manipulação de líquidos. (Usando estéril Multipurpose Liga ou liga (PPM), você também pode anexar o saco de mídia para o navio). </li><li> Fechar os grampos sobre o manuseio de líquidos e tubos de perseguição na HYPERStack. </li><li> Coloque o HYPERStack navio Camada 36 para o CSM na posição de carga; gancho do tubo de respiro do filtro no clamp segurando o CSM. Apertar a tampa e mover o CSM para a posição de enchimento. Ao colocar o navio na posição correta de preenchimento; o filtro de ar está agora em posição mais alta para evitar molhar durante a operação de preenchimento. O 10 ° de ângulo permite equilibrção do líquido para as camadas durante o enchimento. O navio camada HYPERStack-12 colocado de lado na cunha de enchimento é na posição correta para o preenchimento. </li><li> Ar limpo da linha de enchimento, posicionando o saco no mesmo nível que o navio HYPERStack (não superior). Mantendo a fixação de tubo perseguição fechado; abra o grampo do tubo de líquido manuseio e do grampo saco de mídia para permitir que o líquido para entrar no navio. </li><li> Usando o suporte de saco, levante o saco da mídia para ajudar o fluxo de suspensão celular dentro do vaso. </li><li> Encha o copo até que a todos os meios inoculados entra no navio, a 300 mL de mídia ainda deve permanecer na parte superior do saco de mídia. Retire o grampo do saco de mídia para continuar enchimento do reservatório. Como o líquido se aproxima do coletor de ar superior, retardar a taxa de preenchimento, reduzindo o saco da mídia, a fim de evitar o excesso de enchimento. Levar lentamente o nível de líquido para a linha de enchimento e prender o tubo de manipulação de líquidos. </li></ol> 7. Procedimento de isolamento para bloquear líquido nas camadas <ol><li> Trazer o navio HYPERStack no CSM a posição de isolamento para os dois conjuntos de coletores estão em posição mais alta e mais baixa a bolsa de mídia abaixo da altura do vaso. O HYPERStack-12 navio camada pode ser levantado para a posição de isolamento, colocando uma mão no lado do navio e usar a outra para levantar a cunha de enchimento. </li><li> Com o filtro de perseguição realizada em uma posição ereta, abra o grampo do tubo perseguição. Isto vazio ou perseguição da mídia no tubo de manipulação de líquidos de volta para o saco de mídia. Uma vez que o tubo está vazio, fechar a braçadeira no tubo de bolsa de mídia. </li><li> Manter o filtro do tubo de perseguição em uma posição ereta, abra o grampo do tubo de manipulação de líquidos na HYPERStack para permitir que qualquer líquido restante para entrar e se equilibram no vaso. Espere 1-2 minutos para que isso ocorra. </li><li> Por sua vez o navio HYPERStack no CSM, para que os manifolds estão à esquerda. Inferior da embarcação para a posição carga no CSM. Balançando o HYPEStack-12 navio camada ligeiramente para a esquerda vai permitir a eliminação da cunha de enchimento. Fechar os grampos em ambos a perseguição e tubulação para manipulação de líquidos. </li><li> O saco de mídia pode agora ser removido do navio ou que podem permanecer presos para uso posterior no processo de colheita. Para armazenar o saco da mídia anexada, role o saco vazio e qualquer outra mídia restante no saco, e colocar sob as faixas de retenção na bandeja de armazenamento do navio HYPERStack. </li><li> Mover o navio HYPERStack para a incubadora. Quando transportar o cuidado navio devem ser tomadas para manter líquidos de entrar no filtro de ventilação de ar. Isso é realizado por depósito no final do coletor HYPERStack ligeiramente para cima. </li></ol> 8. Protocolo de colheita <ol><li> Para iniciar o procedimento de colheita, tubo de solda a célula solução dissociação e sacos de saciar-se para formar a montagem saco de colheita. Garantir que todos os grampos de tubo estão fechados. (Use cartoon para demonstrar) </li><li> Remover navio HYPERStack da incubadora, solte o saco de mídia sob a bandas de retenção, e pendurar no stand saco. Coloque o recipiente no CSM com a carga e aperte a tampa para proteger o navio. Gancho da tubulação de ventilação para o grampo holding e mova o CSM para a posição de enchimento. </li><li> Certificando-se o saco de mídia no stand saco está pendurado inferior ao HYPERStack; abra o grampo no tubo saco de mídia e tubulação do navio para manipulação de líquidos para permitir o fluxo de mídia para dentro do saco em anexo. </li><li> Uma vez que o navio é de cerca de ¾ vazia, altere as configurações CSM para a posição final vazio. Quando o navio HYPERStack e tubulação para manipulação de líquidos estão vazios, levante a tubulação para perseguir os meios de comunicação além do grampo no tubo passou saco de mídia, em seguida, feche ambos prender o tubo na manipulação de líquidos ea braçadeira no tubo passou media saco. </li><li> Substituir o saco de gastos de mídia com a montagem saco de colheita por soldagem do tubo e aumentar a altura do conjunto de saco de dissociação de células acima da altura da HYPERStack usando o suporte de saco. </li><li> Coloque o CSM na posição de equilíbrio. Abra a célula de tubo solução dissociação grampo e transferir a solução para o HYPERStack. Quando a transferência estiver concluída, feche os grampos na tubulação de manipulação de líquidos ea célula tubulação solução dissociação. </li><li> CSM trazer para a posição de carga. Mantendo o posicionamento da alavanca horizontal aberta, agite levemente o lado navio para o lado usando a roda, distribuindo a solução sobre as camadas de células. O navio pode ocasionalmente ser devolvido para a posição de equilíbrio durante o balanço para manter a distribuição igual da solução. Pode não ser visualmente evidente que as camadas são completamente revestido, mas a solução dissociação serão distribuídos igualmente por toda a superfície das células. Uma vez que a solução tem sido adequadamente distribuídos, solte a alavanca do CSM para bloquear o HYPERStack na posição de carga. Deixe o HYPERStack nesta posiçãodurante o tempo necessário para a dissociação de suas células. </li><li> Uma vez que as células têm destacado, usando turbidez como um guia, mover o CSM para a posição de equilíbrio. Cuidados devem ser tomados para não mais de digerir as células. Abra o grampo saco saciar eo líquido HYPERStack abraçadeira de tubo para permitir a manipulação da mídia saciar a entrar no navio. Feche a braçadeira no tubo de manipulação de líquidos HYPERStack uma vez que a transferência estiver completa. </li><li> Devolver o CSM para a posição de carga e segure a alavanca de posicionamento horizontal para balançar o navio lado a lado. </li><li> Usando o suporte de saco, baixar a posição da assembléia saco safra abaixo do nível do HYPERStack. Ajustar o CSM para a posição vazia, abra o recipiente para manipulação de líquidos tubo braçadeira e transferir a solução de células de volta para o saco de matar. Devolver o CSM para a posição de carga e desconecte o conjunto da bolsa colheita do navio usando um aferidor tubo. A solução celular está pronto para processamento. </li></ol> 9. Resultados representante <ul><li> Tempo da colheita precisa ser otimizado ao converter de uma superfície padrão de poliestireno para a superfície de poliestireno gás-permeáveis. Células tendem a liberar mais rapidamente sobre o produto HYPERStack. </li><li> Para visualizar as células sob um microscópio o tubo de ventilação e tratamento de líquidos precisa ser pinçada fora. Colocar o recipiente HYPERStack cabeça para baixo, com os manifolds apontando para baixo, no palco microscópio. </li><li> Medidas de prevenção podem ser tomadas para evitar molhar os filtros durante o uso que fará com que eles parem de funcionar. Por não mais do enchimento do reservatório HYPERStack e manter a ventilação e os tubos de perseguição elevado quando os grampos estão abertas, não molhar deve ocorrer. </li><li> A pressão dos grampos fechados no tubo faz com que ela permaneça fechada após os grampos são abertas. Beliscar o tubo na direção oposta irá abri-lo. </li><li> Tempo de fluxo de mídia que entram e saem do navio HYPERStack via feed gravidade é baseado na diferença de altura de mídia entre o nível mais alto de mídia no vaso HYPERStack e no nível superior de mídia no recipiente de mídia. Quanto maior a distância, mais rápido o fluxo. A vazão máxima é limitada pela classificação dos filtros para 1.5L/min. </li><li> Manutenção de volume de enchimento adequada no vaso HYPERStack irá prevenir a formação de bolhas de ar nas câmaras de crescimento celular. Bolhas de ar podem ocorrer devido à amostragem ou incubar em um ambiente unhumidified devido à evaporação da água. O valor de amostragem ea frequência, assim como condições de incubação vai determinar se o fluido deve ser adicionado pelo usuário final. </li></ul><img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Depleção de oxigênio dos meios de comunicação em um recipiente padrão de cultura celular. A figura mostra a redução em mg / L de oxigênio ao nível das células ao longo de 3 dias. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Gradiente de oxigênio na mídia em um recipiente padrão de cultura celular. A figura mostra a mg / L de oxigênio é maior no cruzamento de mídia para headspace do que na camada de células. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Percentual de oxigênio no espaço traqueal do HYPERStack durante o crescimento celular. A figura mostra que mais de 96 horas, a porcentagem de oxigênio entre as camadas, que abastece de gás a cada fundo de película permeável, permanece constante. Isso demonstra a capacidade das células para o acesso de oxigênio durante o crescimento de confluência.

O navio HYPERStack gás permeável a tecnologia é coberto pela Patente dos EUA #: 7745209. Os autores são funcionários da Corning Life Sciences, Inc, que produz o instrumento utilizado neste artigo.

HYPERStack navio tem crescido com sucesso engenharia, pilhas e tronco. Adições fluido no vaso foram realizados através de conexões asséptico saco de alimentação por gravidade e também pelo bombeamento de um recipiente estéril media. O navio oferece um aumento de 2,5 vezes maior do que em área de crescimento versus um produto chapa empilhados da mesma pegada volumétrica. O HYPERStack-12 tem 6.000 centímetros área de crescimento 2, o HYPERStack-36 tem 18 mil centímetros área de crescimento 2, eo HYPERStack-120 tem 60.000 cm 2 de área de crescimento. Ao aumentar a área de superfície, os usuários são capazes de produzir mais células da população de células iguais ou muito e reduzir a variabilidade. Eles também são capazes de economizar espaço e / ou de trabalho, recorrendo menos navios para alcançar a saída mesma célula, ou aumentar a produção de células sem adicionar pessoas, suites sala limpa, ou incubadoras. O sistema é produzido com métodos de montagem de partículas de baixa e sem o uso de adesivos. É um sistema fechado, que é pré-montado com conjuntos de tubos e filtros, triple ensacado e fornecidos estéreis.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1.5L Bagged Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>1350ml media + 150ml serum (if required)</td>
</tr>
<tr>
<td>4.0L Bagged Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>3600ml media + 400ml serum (if required)</td>
</tr>
<tr>
<td>HYPERStack Vessel-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>10012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HYPERStack Vessel-36</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>10036</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filling Wedge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>10040</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stack Manipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>TBD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HyQtainer Sub-Assembly Sampling Device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone/LonzA</td>
<td>SH3B0324.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>600ml Bagged Media Quencher (10% FBS IMDM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>600ml Cell Dissociation Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>TBD</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

closed system cell culture protocol using hyperstack vessels with gas permeable material technology

Grande volume de cultura de células aderentes está padronizado na placa empilhados produtos crescimento celular quando microcarregador contas não são uma escolha ideal. Vasos HYPERStack permitir escala sistema fechado a partir do atual placa de produtos empilhados e entrega&gt; 2,5 vezes mais células na pegada volumétrica mesmo. Os vasos HYPERStack função através de material permeável ao gás que permite a troca de gás para ocorrer, portanto, eliminando a necessidade de headspace interna dentro de um vaso. A eliminação de headspace permite que o compartimento onde o crescimento celular ocorre a ser minimizada para reduzir o espaço, permitindo mais camadas de células área de superfície de crescimento dentro da pegada volumétrica mesmo. Para muitas aplicações, tais como a terapia celular ou a produção de vacinas, um sistema fechado é necessária para o crescimento celular e colheita. O navio HYPERStack permite que celulares e reagente adição e remoção através de tubos de sacos de mídia ou de outros métodos. Este protocolo irá explicar a tecnologia por trás do material permeável ao gás usado nos vasos HYPERStack, os resultados de difusão de gás para atender as necessidades metabólicas das células, sistema fechado de protocolos de crescimento celular, e vários métodos de colheita.

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Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Uma introdução à tecnologia de protocolo, e manuseio das embarcações Corning HYPERStack e acessórios utilizados para cultura de células de alto rendimento aderente. O protocolo irá mostrar como usar os vasos sistema fechado para a colheita de células a aumentar ao longo produtos empilhados placa atual.

Sistema de Protocolo fechado Cultura de Células utilizando navios com HYPERStack Gas Technology material permeável

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

closed-system-cell-culture-protocol-using-hyperstack-vessels-with-gas

Research

JoVE Journal

Biology

18.7K visualizações.  Corning Life Science. Uma introdução à tecnologia de protocolo, e manuseio das embarcações Corning HYPERStack e acessórios utilizados para cultura de células de alto rendimento aderente. O protocolo irá mostrar como usar os vasos sistema fechado para a colheita de células a aumentar ao longo produtos empilhados placa atual.

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Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular biology. Site-specific recombinases are proteins that bind to distinct DNA target sequences. The Cre/lox system was first described in bacteriophages during the 1980's. Cre recombinase is a Type I topoisomerase that catalyzes site-specific recombination of DNA between two loxP (locus of X-over P1) sites. The Cre/lox system does not require any cofactors. LoxP sequences contain distinct binding sites for Cre recombinases that surround a directional core sequence where recombination and rearrangement takes place. When cells contain loxP sites and express the Cre recombinase, a recombination event occurs. Double-stranded DNA is cut at both loxP sites by the Cre recombinase, rearranged, and ligated ("scissors and glue"). Products of the recombination event depend on the relative orientation of the asymmetric sequences.
SSR technology is frequently used as a tool to explore gene function. Here the gene of interest is flanked with Cre target sites loxP ("floxed"). Animals are then crossed with animals expressing the Cre recombinase under the control of a tissue-specific promoter. In tissues that express the Cre recombinase it binds to target sequences and excises the floxed gene. Controlled gene deletion allows the investigation of gene function in specific tissues and at distinct time points. Analysis of gene function employing SSR technology --- conditional mutagenesis -- has significant advantages over traditional knock-outs where gene deletion is frequently lethal.

Principles of Site-Specific Recombinase SSR Technology

The advent of site-specific recombinase (SSR) technology and the Cre/lox system has led to numerous advances in molecular biology, and has proven itself as a valuable tool for assessing gene function in transgenic animals. This interview discusses the mechanism of site specific recombination by Cyclization recombinase (Cre) and how the use of this enzyme has led to the development of conditional mutagenesis, which has significant advantages over traditional knock out strategies.

Princípios do site-specific Recombinase (SSR) Tecnologia

Site-specific recombinase (SSR) technology allows the manipulation of gene structure to explore gene function and has become an integral tool of molecular ...

Biologia

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

Engenharia de Proteínas Cell-permeáveis

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

O método de cultura de embriões de roedores inteiro usando o Rotator do tipo Sistema de Cultura Garrafa

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and accuracy. Cell counts are important for monitoring cell health and proliferation rate, assessing immortalization or transformation, seeding cells for subsequent experiments, transfection or infection, and preparing for cell-based assays. It is important that cell counts be accurate, consistent, and fast, particularly for quantitative measurements of cellular responses.
Despite this need for speed and accuracy in cell counting, 71% of 400 researchers surveyed1 who count cells using a hemocytometer. While hemocytometry is inexpensive, it is laborious and subject to user bias and misuse, which results in inaccurate counts. Hemocytometers are made of special optical glass on which cell suspensions are loaded in specified volumes and counted under a microscope. Sources of errors in hemocytometry include: uneven cell distribution in the sample, too many or too few cells in the sample, subjective decisions as to whether a given cell falls within the defined counting area, contamination of the hemocytometer, user-to-user variation, and variation of hemocytometer filling rate2.
To alleviate the tedium associated with manual counting, 29% of researchers count cells using automated cell counting devices; these include vision-based counters, systems that detect cells using the Coulter principle, or flow cytometry1. For most researchers, the main barrier to using an automated system is the price associated with these large benchtop instruments1.
The Scepter cell counter is an automated handheld device that offers the automation and accuracy of Coulter counting at a relatively low cost. The system employs the Coulter principle of impedance-based particle detection3 in a miniaturized format using a combination of analog and digital hardware for sensing, signal processing, data storage, and graphical display. The disposable tip is engineered with a microfabricated, cell- sensing zone that enables discrimination by cell size and cell volume at sub-micron and sub-picoliter resolution. Enhanced with precision liquid-handling channels and electronics, the Scepter cell counter reports cell population statistics graphically displayed as a histogram.

The Scepter Cell Counter is a handheld automated device that can be used to count cells, monitor cell diameter and volume, and be used to check the health and quality of cellular populations from one culture to the next.

Determinação do Número celular durante Cultura Celular usando o contador de células Scepter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

A Triagem procedimento químico para Glucocorticoid Sinalização com um Sistema Reporter Zebrafish Zergling luciferase

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Uma<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema Cultura para estudar o desenvolvimento da tireóide

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

Um Protocolo de vídeo de infecção retroviral na Primária Intestinal organóide Cultura

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Entrega Protein direto para células de mamíferos utilizando células-permeável Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Domínios zinc-finger

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Desenvolvimento de um Sistema Insert Co-cultura de dois tipos celulares na ausência de célula-célula Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Protocolo do laboratório para análises genéticas de conteúdo intestino de rDNA usando de macroinvertebrados aquáticos grupo-específicos Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...