Este projeto foi o apoio em parte pela Johns Hopkins University, Gabinete do Reitor através da Iniciativa Ciência Gateway.

<ol><li> Comece a operação com a configuração do navio. Um fermentador convencional tem os seguintes componentes que necessitam de ser instaladas (Figura 1): <ol><li> sonda de pH - para a medição do pH na cultura viva. Calibrar sonda antes da instalação e esterilizar com o navio. Instalar sonda no headplate. </li><li> pO 2 sonda - para a medição do teor de oxigênio dissolvido no interior do navio durante a fermentação. Instalar na headplate. </li><li> Tubo de colheita para a amostragem da cultura. Instale este componente altura ajustável na headplate. </li><li> Aspersor de gás - reside na parte inferior do recipiente e fornece infusão de gás para a cultura. Gancho sparger até a fonte de gás no fermentador e montar no headplate. </li><li> Veio do rotor e do rotor - do impulsor agita a cultura e é crítica para a manutenção da uniformidade da cultura no vaso. </li><li> Dos gases de escape do condensador - para reduzir a perda por evaporação no reservatório de arrefecimento o caminho dos gases de escape. </li><li> As linhas de bomba de reagentes para controle de pH ou adição na ração. </li></ol></li><li> Limpar o vaso e headplate com sabão e água. A escova macia é recomendada para esfregar o vaso e headplate. Lixívia ou produtos de limpeza com cloro não pode ser usado para limpar o vaso. </li><li> Se a mídia não é o calor lábil, adicioná-lo ao recipiente limpo. Só adicionar até que o volume de trabalho máxima é atingida. Neste caso, o volume de trabalho máxima é de 3,3 L para uma embarcação volume total de 5 L. </li><li> Monte o headplate navio, garantindo que o anel de vedação está bem encaixado. </li><li> Instale o condensador de gases de escape. </li><li> Instale a sonda antiespumante em sua porta de 10 mm. </li><li> Instale o tubo de colheita em sua porta de 10 mm. Coloque um pedaço de tubo na parte de cima e prenda-o. </li><li> Instale a tubulação e um filtro de 0,20 mM na entrada sparge e, em seguida, apertar esta off. </li><li> Calibrar a sonda pH: <ol><li> Reúna dois buffers de referência em pequenos copos, uma garrafa de lavagem, e um wa reposiçãoproveta sh. </li><li> Prenda o pH sonda até o fermentador e virar o fermentador diante. </li><li> Vá até o parâmetro pH e usando o botão de menu, vá até a opção &#39;Cal&#39;, e pressione &#39;Enter&#39;. </li><li> Selecione &#39;2 &#39;para a calibração de 2 pontos. </li><li> Lavar a ponta da sonda e submergir no buffer de referência baixo. O valor no fermentador irá estabilizar. Usando a teclas + e -, ajustar o valor exibido para coincidir com o valor do buffer de referência de pH. Uma vez que ele pára de piscar, pressione &#39;Enter&#39;. </li><li> Lave a sonda fora e inseri-lo no segundo tampão de referência. Permitir que o valor para estabilizar e, em seguida, utilize o teclado para fazer o valor apresentado corresponde ao valor do buffer de alta referência. Pressione &quot;Enter&quot; para confirmar. </li><li> Lave a ponta da sonda e desconecte-o do fermentador. Coloque a tampa de proteção na conexão e instalá-lo no headplate. </li></ol></li><li> Abra a ponta da sonda pO 2 e verifique se háeletrólito é suficiente para cobrir a ponta. Se não, adicione um pouco para o reservatório e fechá-lo de volta. </li><li> Instale a sonda pO 2 no headplate e certifique-se de que a tampa é colocada em autoclave para proteger suas conexões elétricas. Vai ser calibrado depois de esterilização. </li><li> Obter uma garrafa para alimentação do reagente com um tubo de imersão e filtro de ar. Adicionar tubulação de bomba à porta de tubo de imersão e conecte a outra extremidade à porta de entrada no fermentador. </li><li> Local tubulação em todas as portas não utilizadas, em seguida, apertar a tubulação fora. </li><li> Instalar um filtro de 0,45 um no condensador os gases de escape. Este filtro assegura que o recipiente não é pressurizar na autoclave. </li><li> Verifique se todos os tubos que vão abaixo do nível dos meios de comunicação são presas off para evitar que materiais de sair. </li><li> Colocar o recipiente em autoclave durante 25 - 30 min a 121 ° C, ciclo de líquidos. Cuidado: Quando ele sai ele vai estar muito quente. </li><li> Instale o navio na base fermentador. </li><li> Ligue o pHsondar a cabo. </li><li> Conecte o cabo da sonda pO 2. </li><li> Prenda o pulverizador até o rotâmetro adição de gás. </li><li> Esterilmente adicionar um reagente NaOH M para a garrafa com o tubo de imersão e instalar a cabeça da bomba sobre a cabeça do eixo da bomba de base. </li><li> Coloque o sensor de temperatura no poço no headplate. Certifique-se de que ele vai todo o caminho até o fundo do poço. </li><li> Abaixe o braço de agitação para o acoplamento vasos impulsor. </li><li> Certifique-se de que o fermentador está ligado. </li><li> Entrada de água que está disponível para o fermentador. </li><li> Ligue o suprimento de ar para o fermentador. </li><li> Vá até o parâmetro de temperatura e ajustar a temperatura para 37 ° C. Pressione o botão &quot;Enter&quot; para iniciar o controle de temperatura. O navio vai esquentar em 15 min ou menos. </li><li> Vire o fluxo de gás para um volume do reservatório de mídia por minuto ou menos. Para esta configuração, o fluxo de gás é de 3 L / min. Bubbles deve aparecer na parte inferior. </li><li> Vá até a agitação parameter e ajustado para 300 rpm. Pressione &quot;Enter&quot; para ligar a agitação. </li><li> Quando a temperatura atingiu 37 ° C, vá até o parâmetro pH e configurá-lo para 6,8. Gire o controle de pH, pressionando o botão &quot;Enter&quot;. </li><li> Definir agitação à velocidade máxima de 1.000 rpm para a corrida. </li><li> Certifique-se de que a sonda pO 2 é polarizado corretamente para exibir valores adequados. Depois de 2 horas, vá até o parâmetro pO 2 e use o botão &quot;Menu&quot; para selecionar o &#39;Função Calibrar &quot;e selecione a calibração de 1 ponto. </li><li> Após 15 min, use os cursores para definir o valor a 100 e pressione &#39;Enter&#39;. Isto irá calibrar pO 2. </li><li> Vá até a agitação e definido para 300 rpm. </li><li> Usando o botão &quot;Menu&quot;, rode o &#39;Cascata&#39; para &#39;on&#39; no menu agitação. Isto irá aumentar a velocidade de agitação, em um esforço para cortar-se bolhas de ar e forçar mais oxigênio em solução enquanto a demanda de crescimento aumenta. </li&gt; <li> Vá até o parâmetro pO 2 e defina o valor para 30. Pressione o botão &quot;Enter&quot; para iniciar a pO 2. </li><li> Inicie o pacote de software de controle no PC. </li><li> Uma vez que as sondas são calibradas, a agitação é estável a 300 rpm, a temperatura é de 37 ° C e o pH é próximo de 6,8, isto é o tempo para inocular. A utilização do álcool, esterilizar a porta que vai ser utilizado para a inoculação. </li><li> Desenhar o inoculo para uma seringa e adiciona-o à porta esterilizado. Feche a porta. </li><li> Marque o tempo de inoculação em um livro de registro. </li><li> Também é importante ter uma amostra em vez de esterilização. Esterilizar a extremidade do tubo do tubo de colheita com álcool. </li><li> Abra o grampo que cobre a porta colheita e usar uma seringa para tirar uma amostra. Esta primeira amostra é geralmente descartado porque se tem sentado no tubo. </li><li> Use outra seringa para puxar outra amostra. </li><li> Com uma terceira seringa, empurrar o ar para trás através do tubo para remover o máximo volume mortoa partir da linha e prender a linha off. </li><li> Determinar a densidade de células e pH e registrar os valores. Com culturas microbianas, é útil para registrar valores de cada hora. Intervalo é a cultura dependente. </li><li> Metodologia de colheita depende da intenção para a cultura após o término do crescimento. Neste caso, experimentar a cultura uma última vez para receber valores de ponto final para a densidade celular e possível pH ou medição do peso celular molhado. Abra o headplate eliminados os conteúdos em um designado &quot;tanque matar&quot; com lixívia ou outros agentes antimicrobianos. </li></ol>

<ol>
	<li>Shuler, M., Kargi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioprocess Engineering Basic Concepts. , (2002).</li><li>Hambor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor+Design+and+Bioprocess+Controls+for+Industrialized+Cell+Processing.">Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing.</a> BioProcess International. 10 (6), 22-33 (2012).</li><li>Julien, C., Whitford, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioreactor,+Monitoring,+Modeling+and+Simulation.">Bioreactor, Monitoring, Modeling and Simulation.</a> BioProcess International. 5 (01), S10-S17 (2007).</li><li>Fike, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+Supplementation+Strategies+for+Biopharmaceutical+Production.+Part+1:+Identifying+a+Formulation.">Nutrient Supplementation Strategies for Biopharmaceutical Production. Part 1: Identifying a Formulation.</a> BioProcess International. 7 (11), 46-52 (2009).</li><li>Jana, S., Deb, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+efficient+production+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli.">Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 67, 289-298 (2005).</li><li>Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+K5+fermentation+and+the+preparation+of+heparosan,+a+bioengineered+heparin+precursor.">E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor.</a> Biotechnol. Bioeng. 107, 964-973 (2010).</li><li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).</li><li>Infors, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Minifors operating Manual and user guide. , .</li></ol>

Autor A. Magno é um funcionário da ATR Biotech que produz reagentes e instrumentos utilizados neste artigo.

Biorreatores de tanque agitado são o padrão da indústria de biotecnologia e têm sido utilizados por mais de 40 anos 1. O pequeno tanque agitado tem sido importante para o aumento de escala, escala-down, otimização de tensão, caracterização e desenvolvimento de processos. Também pode ter um papel importante no desenvolvimento da medicina individualizada 2. O biorreator de pequena escala é mais parecida com condições in situ para o crescimento celular, porque ele pode ser monitorado e otimizado ao longo de um prazo. Na maioria das vezes, as experiências iniciais são realizadas usando balões de agitação, mas as condições no biorreactor de pequena escala difere significativamente do balão de agitação. Em um experimento verificou-se que as condições para o crescimento ideal do E. coli e a produção de Proteína Fluorescente Verde (GFP) no frasco de agitação não se traduziu para o tanque agitado (dados não publicados). Outros métodos de células cultivadas em larga escala incluem garrafas de rolo, único use balançando biorreatores plataforma 3 e maiores biorreatores de uso único com volumes de trabalho de 50 para 5.000 L. Cada método oferece desafios para scale-up, mas encontrou um lugar em produção. O uso único de balanço plataforma bioreactor é semelhante ao tanque agitado, e proporciona um ambiente regulado. Difere do tanque agitado em que a mistura ocorre devido um movimento de balanço para gerar ondas para impedir a sedimentação das células e fornecer oxigenação. A hidrodinâmica para este método são diferentes do tanque agitado e volume máximo é limitado a 1,000 L. As diferenças podem afectar o crescimento celular e produção de produto. Outros sistemas de uso único combinar o tanque agitado com o reator descartável para, fornecer uma plataforma com um mínimo de infra-estrutura e sobrecarga associada, ea capacidade de high-throughput Bioprocessing 4. Novos usuários de biorreatores de bancada pode ter problemas para determinar valores nominais iniciais para pH, pO 2 e temperaturatura, no entanto, a pesquisa publicada pode ser referenciado por esta informação 5, 6, 7, 8, 9. Com culturas de bactérias, em particular, recomenda-se iniciar a agitação à mesma velocidade que o balão agitador e a temperatura ao mesmo ponto de ajuste. Cultura de pH a partir de frascos de agitação é executado anteriores também podem ser utilizadas como um ponto de partida. Ajuste do valor pO 2 é mais difícil e normalmente é determinado empiricamente. No entanto, começando com 50% pO 2 é um ponto de partida recomendado.

A tecnologia básica de fermentação é uma extensão da técnica frasco agitado simples para o cultivo de culturas. Ele cresceu a partir do desejo de controlar os ambientes de crescimento para culturas vivas de uma forma mais completa e quantitativa. Lote frascos agitados cultura são geralmente limitados pelo controle impreciso da temperatura. Uniformidade de temperatura em um shaker incubadas ou sala quente é altamente variável, às vezes desviando 5 ° C ou mais, do ponto de ajuste pretendido. Uma vez que o balão de agitação é normalmente agitada a uma velocidade fixa, a troca de oxigénio e absorção de gás é limitado. Uma vez que o oxigênio ambiente disponível se esgota, a maioria das culturas não conseguem prosperar. Não há nenhum controlo do pH em frascos de agitação. Em muitos casos, se a cultura não é limitada pela carga de alimentação, torna-se ácida até ao ponto de prejudicar a cultura e respiração diminui drasticamente. A maioria das culturas em balão de agitação também são executados como um &quot;lote&quot;, o que significa que eles são alimentados apenas uma vez em ou perto do início das culturas inoculation. Após esta fonte de carbono inicial é consumida, a cultura pára de crescer. Em alguns casos, o seu metabolismo pode deslocar e começar a consumir outros metabolitos no caldo de cultura, por vezes, alterando as características da biomassa resultante ou proteína. Shaker também são geralmente sujeitos a mídia a perda por evaporação em ambientes de cultura mais quentes, geralmente 10% do volume por 24 horas a 37 ° C. Esta perda altera a densidade da cultura e proíbe o funcionamento a longo prazo do sistema. Por fim, o usuário pode encontrar a formação de espuma da mídia após agitação. A ocorrência de espuma no espaço de cabeça acima da cultura vai limitar as trocas gasosas e um maior crescimento do joelho. O sistema básico de fermentação é projetado para lidar com todas essas limitações. Controle cuidadoso da temperatura é conseguido em recipientes de fermentação pela utilização de agitação do impulsor e uma camisa de aquecimento. Um sensor inserido no navio e feedback de controle de aquecimento e arrefecimento de uma jaqueta normalmenteresulta em controle de temperatura ± 0,1 ° C em torno do valor nominal. Fermentadores de bancada geralmente fornecem o controle de pH através de adição de reagentes líquidos através de uma bomba. O valor de pH é monitorado continuamente, em um esforço para manter o ambiente ideal para o crescimento celular. Arejamento adequado é mantido pelo impulsor de mistura acima mencionada ou pela infusão de ar ou oxigénio gasoso suplementado directamente na cultura. Com culturas sensíveis ao cisalhamento, o gás oxigênio complementada é o principal mecanismo para a manutenção do nível de oxigênio na cultura. A medição do oxigénio em solução é geralmente conseguido por uma sonda polarográfica que não está normalmente disponível para utilização em frascos de agitação. Também é possível adicionar de forma contínua ou periodicamente de alimentação para o recipiente para manter o crescimento de uma forma linear ou exponencial. O gás de saída do condensador fornece uma superfície fria de vapor no fluxo dos gases de escape para condensar, preservando assim o volume da cultura e densidade. Adição periódica de anti-espuma tensioactivo é actuadapor uma sonda de condutividade na cultura, a redução de espuma na superfície e permitindo a troca de gás. O navio, com todas as sondas, acessórios, impulsores, tubos de colheita, e tubos, é montado e esterilizado num autoclave padrão. Após as calibrações de sonda final de estabilização e ao ambiente de operação, a cultura é adicionada ao recipiente. O sistema pode, então, ser utilizado para caracterizar a cultura de uma forma que é mais quantitativo e preciso do que com um método em frasco de agitação. O controlo rigoroso da temperatura, pH, teor de oxigénio, consumo de alimento, o líquido de evaporação, e níveis de espuma contribuem para uma biomassa muito mais elevada e melhor rendimento de proteína.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="356">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:117px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">LB broth</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">L3022</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">ampicillin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">A1593-25G</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">LB broth</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">L3022</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">antifoam 204</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">A8311</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;"> </td>
			<td style="width:117px;"> </td>
			<td style="width:117px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">1 M Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td>38215-1EA-R</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Reference Buffer, pH 4.00</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">B5020</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Reference Buffer, pH 7.00</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:117px;">B4770</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">pO2 probe electrolyte</td>
			<td style="width:117px;">Broadley James</td>
			<td>AS-3140-C30-0025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">0.45 micron filter</td>
			<td style="width:117px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-02915-22</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:123px;">0.22 micron filter</td>
			<td style="width:117px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-29950-40</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Luer Lock syringe, 10 mL</td>
			<td style="width:117px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-07940-12</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Minifors Bioreactor</td>
			<td style="width:117px;">Infors HT</td>
			<td style="width:117px;">B-Pack 5.0</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">Air Admiral air pump</td>
			<td style="width:117px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:117px;">EW-79202-00</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:123px;">1175 PD Chilling circulator</td>
			<td style="width:117px;">VWR</td>
			<td style="width:117px;">13721-204</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

operation of a benchtop bioreactor

Sistemas de fermentação são usados ​​para proporcionar um ambiente de crescimento ideal para muitos tipos diferentes de culturas de células. A capacidade proporcionada pela fermentadores para controlar cuidadosamente a temperatura, o pH e as concentrações de oxigénio dissolvido, em particular, torna essencial para o crescimento em larga escala eficiente e da expressão de produtos de fermentação. Este vídeo vai descrever brevemente as vantagens do fermentador durante o balão de agitação. Ele também irá identificar os principais componentes de um sistema de fermentação típico de bancada e dar instruções básicas sobre a configuração do navio e calibração de suas sondas. O telespectador vai se familiarizar com o processo de esterilização e mostrado como inocular o meio de crescimento no vaso com a cultura. Conceitos básicos de operação, a amostragem, e colheita também será demonstrado. Também será discutida a análise de dados simples e limpeza do sistema.

O biorreactor pode ser executada com ou sem o software IRIS. No entanto, para capturar dados, é melhor usar o software. Antes de adição de bactérias, os sensores de pH e oxigênio deve ser calibrado, o conjunto de velocidade do rotor eo conjunto de temperatura. Na Figura 2, a saída de dados para um biorreactor de execução é apresentado. A temperatura foi ajustada para 30 ° C, a velocidade do impulsor de 200 rpm. Os parâmetros podem ser diferentes para cada experiência, mas antes da adição de bactérias, o sistema deve estar no estado estacionário. Na Figura 3, a variação da concentração de oxigénio, com a adição da cultura bacteriana é mostrado. Os pontos de ajuste para esta experiência são 37 ° C, agitação a 200 rpm, O 2 a 70%. No momento 19:20, a bomba de alimentação fornece a cultura semente bacteriana em um OD de 0,1 causando uma queda de imediato no nível de O 2. O biorreactor responde ao O 2 nível mudando com o aumento do fluxo de ar e velocidade do impulsor. Tele set-points para os aumentos são definidos em cascata (passo 35). O pH do reactor foi monitorizada em tempo real, com a diminuição do pH, em seguida, aumentando, como demonstrado pela linha de flutuação do pH ao longo do tempo (Figura 4). Toda a execução pode ser analisada e os parâmetros ajustados para os experimentos posteriores. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig1.jpg" /> Figura 1. Biorreator de bancada com todas as partes marcadas e ligadas. Esta figura mostra o reactor de tanque agitado, no início de uma corrida. As partes do reator são rotulados e incluem os sensores, rotor, medidor de temperatura, garrafas de alimentação e de amostragem, porta de escape, medidor de pressão de ar, câmara de aquecimento, torre de condensador, e painel de controle. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig2.jpg" /> Figura 2. Imagem da tela do biorreator software no início da corrida. No início de uma corrida de tanque com agitação, a temperatura foi fixada em 30 ° C (linha verde), a velocidade do rotor para 200 rpm (linha vermelha), pH 6,5 (linha verde), e pO 2 em 57,2% (linha azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig3.jpg" /> Figura 3. Imagem da tela do software biorreator durante a corrida como o oxigênio diminui. Quando a cultura está em fase de crescimento ativo, consome oxigênio ea quantidade de oxigênio no reator é reduzida (linha azul). Através do aumento da velocidade do rotor, mais oxigénio pode ser adicionado à cultura (linha a vermelho). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ampliar figura</a> . Figura 4. A imagem do ecrã de software bioreactor que mostra a mudança do pH ao longo do tempo. Se o pH da cultura é monitorizado continuamente ao longo do tempo e diminui à medida que o ácido láctico é produzida e, em seguida, aumenta como base é adicionada ao bioreactor (linha azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ampliar figura</a> .

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Operation of a Benchtop Bioreactor

Os fermentadores são usadas para aumentar o rendimento da cultura e da produtividade de células de bioengenharia. Após triagem vários microbianos ou animais de cultura de células candidatos em shaker, o próximo passo lógico é aumentar a biomassa da cultura selecionada com o fermentador. Este vídeo demonstra a instalação e operação de um sistema de bancada biorreator típico.

Funcionamento de um biorreator de bancada

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

88.3K visualizações.  Johns Hopkins University.  Os fermentadores são usadas para aumentar o rendimento da cultura e da produtividade de células de bioengenharia. Após triagem vários microbianos ou animais de cultura de células candidatos em shaker, o próximo passo lógico é aumentar a biomassa da cultura selecionada com o fermentador. Este vídeo demonstra a instalação e operação de um sistema de bancada biorreator típico. 

Vídeo: Operation of a Benchtop Bioreactor

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Engenharia Biológica Baseado em enxertos vasculares Usando um biorreator pulsátil

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Bioengenharia

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

Projeto de um biorreator Carregando Mecânica Biaxial para Engenharia de Tecidos

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 &#181;m. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.

A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(&#949;-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.

Construção e Caracterização de um biorreator Fold Novel Vocal

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

O cultivo de células de mamíferos utilizando um uso único sistema pneumático Bioreactor

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

Um biorreator Novel de Cultivo de Alta Densidade de diversas comunidades microbianas

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. Ultrasound-mediated sonoporation is an emerging technique for rapid intracellular delivery of biomolecules. Sonoporation occurs when cavitation of gas-filled microbubbles forms transient pores in nearby cell membranes, which enables rapid uptake of biomolecules from the surrounding fluid. Current techniques for in vitro sonoporation of cells in suspension are limited by slow throughput, variability in the ultrasound exposure conditions for each cell, and high cost. To address these limitations, a low-cost acoustofluidic device has been developed which integrates an ultrasound transducer in a PDMS-based fluidic device to induce consistent sonoporation of cells as they flow through the channels in combination with ultrasound contrast agents. The device is fabricated using standard photolithography techniques to produce the PDMS-based fluidic chip. An ultrasound piezo disk transducer is attached to the device and driven by a microcontroller. The assembly can be integrated inside a 3D-printed case for added protection. Cells and microbubbles are pushed through the device using a syringe pump or a peristaltic pump connected to PVC tubing. Enhanced delivery of biomolecules to human T cells and lung cancer cells is demonstrated with this acoustofluidic system. Compared to bulk treatment approaches, this acoustofluidic system increases throughput and reduces variability, which can improve cell processing methods for biomedical research applications and manufacturing of cell-based therapeutics.

This protocol describes the assembly and operation of a low-cost acoustofluidic device for rapid molecular delivery to cells via sonoporation induced by ultrasound contrast agents.

Montagem e Operação de um Dispositivo Acoustofluidic para entrega aprimorada de compostos moleculares às células

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. ...

Open-source Toolkit: Benchtop Carbon Fiber Microelectrode Array for Nerve Recording

Conventional peripheral nerve probes are primarily fabricated in a cleanroom, requiring the use of multiple expensive and highly specialized tools. This paper presents a cleanroom "light" fabrication process of carbon fiber neural electrode arrays that can be learned quickly by an inexperienced cleanroom user. This carbon fiber electrode array fabrication process requires just one cleanroom tool, a Parylene C deposition machine, that can be learned quickly or outsourced to a commercial processing facility at marginal cost. This fabrication process also includes hand-populating printed circuit boards, insulation, and tip optimization. 
The three different tip optimizations explored here (Nd:YAG laser, blowtorch, and UV laser) result in a range of tip geometries and 1 kHz impedances, with blowtorched fibers resulting in the lowest impedance. While previous experiments have proven laser and blowtorch electrode efficacy, this paper also shows that UV laser-cut fibers can record neural signals in vivo. Existing carbon fiber arrays either do not have individuated electrodes in favor of bundles or require cleanroom fabricated guides for population and insulation. The proposed arrays use only tools that can be used at a benchtop for fiber population. This carbon fiber electrode array fabrication process allows for quick customization of bulk array fabrication at a reduced price compared to commercially available probes.

Here, we describe fabrication methodology for customizable carbon fiber electrode arrays for recording in vivo in nerve and brain.

Kit de ferramentas de código aberto: Benchtop Carbon Fiber Microelectrode Array para gravação de nervos

Conventional peripheral nerve probes are primarily fabricated in a cleanroom, requiring the use of multiple expensive and highly specialized tools. This ...

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is accompanied by high manufacturing costs, which has brought about an interest in using alternative methods for gene delivery. Electroporation is an electro-physical, non-viral approach for the intracellular delivery of genes and other exogenous materials. Upon the application of an electric field, the cell membrane temporarily allows molecular delivery into the cell. Typically, electroporation is performed on the macroscale to process large numbers of cells. However, this approach requires extensive empirical protocol development, which is costly when working with primary and difficult-to-transfect cell types. Lengthy protocol development, coupled with the requirement of large voltages to achieve sufficient electric-field strengths to permeabilize the cells, has led to the development of micro-scale electroporation devices. These micro-electroporation devices are manufactured using common microfabrication techniques and allow for greater experimental control with the potential to maintain high throughput capabilities. This work builds off a microfluidic-electroporation technology capable of detecting the level of cell membrane permeabilization at a single-cell level under continuous flow. However, this technology was limited to 4 cells processed per second, and thus a new approach for increasing the system throughput is proposed and presented here. This new technique, denoted as cell-population-based feedback control, considers the cell permeabilization response to a variety of electroporation pulsing conditions and determines the best-suited electroporation pulse conditions for the cell type under test. A higher-throughput mode is then used, where this 'optimal' pulse is applied to the cell suspension in transit. The steps for fabricating the device, setting up and running the microfluidic experiments, and analyzing the results are presented in detail. Finally, this micro-electroporation technology is demonstrated by delivering a DNA plasmid encoding for green fluorescent protein (GFP) into HEK293 cells.

This protocol describes the microfabrication techniques required to build a lab-on-a-chip, microfluidic electroporation device. The experimental setup performs controlled, single-cell-level transfections in a continuous flow and can be extended to higher throughputs with population-based control. An analysis is provided showcasing the ability to electrically monitor the degree of cell membrane permeabilization in real-time.

A Fabricação e Operação de um Sistema de Micro-Eletroporação de Fluxo Contínuo com Detecção de Permeabilização

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...

Imaging-Guided Bioreactor for Generating Bioengineered Airway Tissue

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in regenerative medicine and bioreactor technologies offer opportunities to produce lab-grown functional tissue and organ constructs that can be used to screen drugs, model disease, and engineer tissue replacements. Here, a miniaturized bioreactor coupled with an imaging modality that allows in situ visualization of the inner lumen of explanted rat trachea during in vitro tissue manipulation and&#160;culture is described. Using this bioreactor, the protocol demonstrates imaging-guided selective removal of endogenous cellular components while preserving the intrinsic biochemical features and ultrastructure of the airway tissue matrix. Furthermore, the delivery, uniform distribution, and subsequent prolonged culture of exogenous cells on the decellularized airway lumen with optical monitoring in situ are shown. The results highlight that the imaging-guided bioreactor can potentially be used to facilitate the generation of functional in vitro airway tissues.

The protocol describes an imaging-enabled bioreactor that allows the selective removal of the endogenous epithelium from the rat trachea and homogenous distribution of exogenous cells on the lumen surface, followed by long-term in vitro culture of the cell-tissue construct.

Bioreator guiado por imagem para geração de tecido das vias aéreas bioengenharia

Repeated injury to airway tissue can impair lung function and cause chronic lung disease, such as chronic obstructive pulmonary disease. Advances in ...