Parte 1: Extração de RNA total utilizando reagente Trizol Quando se trabalha com RNA é muito importante trabalhar em um ambiente que está livre de RNAses. Precauções simples, como ter pipetas reservados para uso apenas com os procedimentos de RNA e pulverizar a área de trabalho com um reagente descontaminante (por exemplo, RNAse Fora) antes de iniciar o procedimento são muito úteis. <ol><li> Para atingir uma quantidade suficiente de RNA piscina de 50 embriões zebrafish em um microtubo de 1,5 ml e remover tanta água quanto possível com uma pipeta. </li><li> Imediatamente adicione 250 mL de reagente Trizol 1 para o tubo de microcentrífuga contendo os embriões. Reagente Trizol contém fenol e só deve ser utilizado sob uma coifa. </li><li> Lyse e homogeneizar os embriões com um pilão pellet (aproximadamente 20 cursos) até que o tecido é suficientemente perturbada. </li><li> Quando as células são suficientemente homogeneizada, adicionar 750 mL de reagente TRIzol para igualar um volume total de 1 ml. </li><li> Para permitir a dissociação completa dos complexos de nucleoproteínas, incubar amostras homogeneizadas por 5 minutos em temperatura ambiente. Nesta fase, a amostra pode ser flash congelado em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ° C ou o protocolo pode ser continuado. </li><li> Para continuar a adicionar 0,2 ml de clorofórmio e agitar o tubo por 15 segundos para misturar. </li><li> Incubar a amostra por 2 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, centrifugar a 12.000 xg por 15 minutos a 4 ° C. </li><li> A mistura será separada em uma fase inferior fenol-clorofórmio vermelho, uma interfase, e uma fase superior aquosa incolor. A fase aquosa superior contém o RNA. A camada superior deve incluir cerca de 60% do volume inicial de TRIzol (aproximadamente 0,6 ml). Transferir a camada superior aquosa para um tubo de microcentrífuga novo usando uma pipeta de 1 ml com cuidado para não transferir qualquer da camada de interfase. </li><li> Para precipitar o RNA adicionar 0,5 ml de isopropanol. </li><li> Permitir que a amostra para sentar-se à temperatura ambiente por 10 minutos e, em seguida, centrifugar a amostra a 12.000 xg por 10 minutos a 4 ° C. RNA formará uma bolinha de gel na parte inferior do tubo. </li><li> Sem perturbar o sedimento, remover o sobrenadante com uma pipeta e lavar o sedimento em 1 ml de etanol 75%. Misturar a amostra por inversão e centrifugar a 7500 xg por 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Após a centrifugação, remover o etanol com uma pipeta e permitir a amostra seca ao mesmo tempo invertido por 10 minutos. </li><li> Ressuspender o sedimento, adicionando 100 ul de água livre de RNAse e incubar a amostra a 55 ° C por 10 minutos. Recomenda-se a dedo vortex freqüentemente durante a incubação para ajudar na reidratação RNA. Opcionalmente, você pode verificar a qualidade e quantidade de amostra usando um ND-1000 NanoDrop espectrofotômetro ou diretamente continuar para a próxima etapa. </li></ol> Parte 2: Limpeza de RNA usando o Qiagen RNEasy Mini Kit A Qiagen RNEasy Mini Kit 2 é útil na remoção de contaminantes e impurezas de uma amostra de RNA isolado de outros métodos. Para este procedimento, β-mercaptoetanol, etanol e água livre de nuclease são necessários além dos componentes incluídos no kit. Um tratamento DNAse opcional é recomendado durante este procedimento. <ol><li> Após a primeira utilização do kit, tampão RPE terá de ser preparado por adição de 4 volumes de etanol 100% para um volume de RPE Buffer. </li><li> No dia do procedimento, tampão RLT terá de ser preparada. Calcule a quantidade total de tampão RLT que serão necessários. Um volume de 350 mL é necessário por amostra. Para preparar RLT Buffer, adicione 10 ml de β-mercaptoetanol para cada 1 ml de buffer. Isto deve ser feito sob a coifa. </li><li> Para cada amostra adicionar 350 uL de tampão RLT e 250 mL de etanol a 100%. Misture bem, pipetando cima e para baixo várias vezes. </li><li> Transferir a amostra, que deve ser de aproximadamente 700 mL, em uma coluna RNEasy que é colocado em um tubo de coleta de 2 ml e centrifugar a 8.000 xg por 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Após centrifugação, descartar a fluir através de e adicione 700 mL de tampão RW1 a uma coluna de spin RNEasy. </li><li> Centrifugar a amostra a 8.000 xg por 1 minuto à temperatura ambiente e, em seguida, descartar a fluir. </li><li> DNAse tratamento com RNAse Qiagen-Free DNAse Kit: DNAse tratamento é opcional, mas é altamente recomendado para as amostras da mais alta qualidade. <ol style="list-style-type:upper-alpha;"><li> Quando você receber o kit de tratamento DNAse, você vai precisar para preparar a solução estoque DNAse I, adicionando água 550 mL nuclease-free para a DNAse. Misture delicadamente por inversão e não vortex. Alíquotas em frascos de utilização única contendo 10 ml da solução estoque. Você pode armazenar a solução estoque a -20 ° C por até 9 meses. As alíquotas descongeladas podem ser armazenadas a 4 ° C durante 6 semanas, se necessário, mas não voltar a congelar as alíquotas após o descongelamento. </li><li> Para preparar a mistura de incubação DNAse eu adicionar 70 mL de buffer RDD para 10 ml DNAse I stock solução por amostra. Misture por inversão suave e tubo de centrifugação rapidamente para recolher o líquido residual dos lados do tubo. Adicionar 80 mL DNAse mix de incubação eu diretamente para a coluna de spin RNEasy. Incubar o tratamento DNAse por 30 minutos em temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Tratamento DNAse seguir adicionar 350 mL de buffer RW1 para a coluna de spin e centrifugar a 8.000 xg por 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Após a centrifugação descartar a fluir através de e adicionar 500 mL de buffer RPE para a coluna de spin. Incubar amostra por 5 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar a 8.000 xg amostra por 1 minuto à temperatura ambiente e descarte a fluir. </li><li> Após a centrifugação adicionar 500 mL de etanol 75% para a coluna de spin. </li><li> Repetir a centrifugação a 8.000 xg, mas por 2 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Após a centrifugação descartar a fluir através de e permitir que a coluna para secar por 5 minutos. </li><li> Imediatamente centrífuga a 8.000 xg por 5 minutos em temperatura ambiente para remover qualquer sobra de vestígios de etanol. </li><li> Após a centrifugação é a transferência completa da coluna de spin em um novo tubo de coleta de 1,5 ml de água e adicionar 10 mL livre de nuclease. Incubar por 1 minuto e então centrifugar a 10.000 xg por 1 minuto à temperatura ambiente. O RNA será no fluir. </li><li> Adicionar outro mL 10 de água livre de nuclease para a coluna girar e incubar a temperatura ambiente por 1 minuto. Centrífuga de amostra a 10.000 xg por 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Após a centrifugação remover e descartar a coluna spin. RNA será no fluir. </li><li> Verificar a quantidade ea qualidade do RNA usando um espectrofotômetro ND-1000 NanoDrop seguindo as instruções do fabricante. </li><li> Além disso, executar um gel desnaturante ou usar um Agilent 2100 Bioanalyzer para verificar a integridade do RNA. </li><li> Amostras devem ser armazenadas a -80 ° C até a síntese de cDNA podem ser executadas. </li></ol> Parte 3: Síntese de cDNA usando a Invitrogen SuperScript Sistema First-Strand RNA é facilmente suscetível à clivagem pela RNAses levando à degradação. Como resultado protocolos expressão muitos gene têm sido desenvolvidos para usar um produto mais estável cDNA que foi diretamente sintetizado a partir do RNA. Aqui síntese detalhamos da vertente do primeiro cDNA usando a Invitrogen SuperScript Sistema de Síntese First Strand-3. Cada reação de síntese de cDNA pode acomodar até 5 mg de RNA. <ol><li> Antes de iniciar o procedimento de mistura e brevemente centrífuga cada componente. </li><li> Prepare RNA / mistura de primers num tubo de microcentrífuga estéril de 0,5 ml, conforme descrito na Tabela 1. </li><li> Incubar a amostra a 65 ° C por 5 minutos. </li><li> Imediatamente para transferir a pasta de gelo por 10 minutos. </li><li> Enquanto a amostra está esfriando preparar uma mistura principal com os componentes descritos na Tabela 2. Os volumes são listados por 1 reação. Ajustar volumes em conformidade, para o número total de reações. </li><li> Após o resfriamento, adicionar 9 mL da mistura principal preparada na etapa 5 para cada RNA / mistura primer. Misture delicadamente e recolher por centrifugação breve. O volume total de cada amostra deve ser de 19 mL. </li><li> Incubar amostra a 42 ° C por 2 minutos em um termociclador. </li><li> Adicionar 1 ml (50 unidades) de SuperScript II RT para cada tubo, misturar e incubar a 42 ° C por 60 minutos em um termociclador. </li><li> Finalizar a reação a 70 ° C por 15 minutos e depois relaxar amostra a 4 ° C. A termociclador pode ser programado para as etapas 8 e 9. </li><li> Depois de o provete ter atingido 4 ° C, transferir a reação a um banho de gelo. </li><li> No gelo adicionar 1 ml de RNAse H a cada tubo e incubar por 20 minutos a 37 ° C. O volume total é agora com 21 mL. Além de RNAse H para a amostra irá degradar o modelo de RNA e deixar apenas o produto único fio cDNA. </li></ol> Parte 4: Isolamento de cDNA e Precipitação <ol><li> Um tubo de 1,5 ml de fase gel bloqueio será utilizado no isolamento do produto cDNA. Prepare um tubo de 1,5 ml de fase gel bloqueio por centrifugação a 12.000 xg por 2 minutos. O gel deve ser todos no fundo do tubo. </li><li> Adicionar 81,5 mL de fenol (Tris-saturadas, tamponado a pH 8,0), 81,5 mL de álcool isoamílico 24:1 clorofórmio, e da amostra (21 mL) para o tubo de gel fase de bloqueio. Mix várias vezes por inversão suave. </li><li> Centrifugar a amostra a 12.000 xg por 5 minutos em temperatura ambiente. </li><li> O cDNA deve ser na fase aquosa superior. Transferir a fase superior para um tubo limpo de microcentrífuga de 1,5 ml. O volume total deve ser cerca de 20 mL. </li><li> Adicionar 1X volume de 3 M NaOAc, pH 5,2 e misture delicadamente. Por exemplo, se o volume da fase aquosa superior foi igual a 20 l, você terá que adicionar 2 l da 3 M NaOAc, pH 5.2. </li><li> Adicionar 7 mL de 5 glicogênio mg / ml e misture delicadamente. </li><li> Adicionar 1X volume de isopropanol e misture delicadamente. Geralmente isto é cerca de 30 mL de isopropanol. </li><li> Deixar a amostra para incubar a temperatur salae por 10 minutos e, em seguida, centrifugar a 12.000 xg por 20 minutos em temperatura ambiente. </li><li> A pelota pequena cDNA deve formar no fundo do tubo. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta. </li><li> Adicionar 500 mL de etanol 70% e misturar por inversão. </li><li> Centrifugar a amostra a 12.000 xg por 5 minutos. </li><li> Após a centrifugação remover o sobrenadante com uma pipeta e repita a lavagem de etanol 70% e centrifugação (etapas 10 e 11). </li><li> Após a centrifugação remover o sobrenadante com uma pipeta. Se houver líquido restante nas laterais do tubo, que podem ser reunidos por breves instantes, girando o tubo. Remova qualquer excesso de líquido e permitir que o pellet secar à temperatura ambiente por 5 minutos. </li><li> Adicionar 20 l de água livre de nuclease para reidratar o sedimento. Colocar a amostra a 55 ° C por 5 minutos para reidratação do sedimento. </li><li> A quantidade ea qualidade do produto cDNA é então verificada usando um espectrofotômetro ND-1000 NanoDrop seguindo as instruções do fabricante. O cDNA pode ser armazenado a -20 ° C. </li></ol> Resultados representante Após a limpeza RNA, cerca de 15 mg de RNA total de alta qualidade pode ser esperado de 50 embriões zebrafish. Para avaliar a qualidade do RNA total, um espectrofotômetro, eletroforese em gel, e um Agilent 2100 Bioanalyzer pode ser usado. A ND-1000 NanoDrop espectrofotômetro pode ser usado para avaliar a absorbância a 260 nm, em comparação com a absorvância a 280 nm (Figura 1). O A 260 / A 280 relação pode revelar a presença de contaminantes e dar indícios de degradação possível. Um A 260 / A 280 de 1,9-2,0 é considerada aceitável. Além disso, é altamente recomendável que um gel desnaturação RNA ser executado para avaliar a integridade do RNA. RNA vai separar em função do seu tamanho, com fios menores migrando mais para baixo do gel. A amostra não-degradada aparecerá como uma mancha com duas bandas fortes. O esfregaço é resultado de uma população de diferentes vertentes mRNA tamanho e as bandas correspondem a 28S e 18S rRNA. A banda 28S deve ser cerca de duas vezes tão intensa como a banda 18S (Figura 2). Alternativamente, a integridade do RNA total pode ser avaliada através de um Agilent 2100 Bioanalyzer. Dois picos distintos representando o rRNA 28S e 18S é esperado (Figura 3). O pico 28S deve ser maior do que o pico de 18S com a área sob os picos de aproximadamente 2:1, respectivamente. Dois picos distintos não será observada em amostras degradadas. Amostras de RNA exibindo degradação não deve ser feita através de procedimentos experimentais subseqüentes. Análise espectrofotométrica pode ser usado para avaliar a qualidade do produto cDNA (Figura 4). O A 260 / A 280 deve ser em torno de 1,8. reações cDNA com uma entrada de 5 mg de RNA total rotineiramente rendimento mg 1-2 de cDNA do produto em nosso laboratório. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Um espectro NanoDrop de amostra de RNA. Após a limpeza RNA, RNA quantidade e qualidade pode ser avaliada através de um ND-1000 NanoDrop espectrofotômetro. Aproximadamente 15 mg de alta qualidade total RNA é rotineiramente rendeu a partir de 50 embriões zebrafish com um A 260 / A 280 em torno de relação de 1,9-2,0. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Um gel desnaturação RNA. Para avaliar a integridade do isolamento do RNA total, um gel desnaturação RNA pode ser executado. Uma mancha com duas faixas brilhantes correspondente a 28S e 18S rRNA é esperado. A banda 28S deve ser de aproximadamente duas vezes mais intensa que a banda 18S. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Um traço de uma amostra de RNA a partir de um Bioanalyzer. Para avaliar a integridade do isolamento do RNA total, as amostras também podem ser analisados ​​em um Agilent 2100 Bioanalyzer. Dois picos, correspondentes aos 28S e 18S rRNA, deve ser visível. O pico 28S deve ser maior do que o pico de 18S com a área sob os picos de aproximadamente 2:1, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Um espectro NanoDrop de uma amostra de cDNA. Análise espectrofotométrica com um NanoDrop ND-1000 pode ser usado para avaliar a quantidade ea qualidade do produto cDNA. O A 260 / A 280 relação deve ser em torno de 1,8. reações cDNA com uma entrada de 5 ug de RNA total rotineiramente rendimento 1-2 ug de cDNA em nosso laboratório. Tabela 1. Componentes para adicionar para RNA / misturas de primer no passo 2 da síntese de cDNA. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Total de RNA (até 5 mg) </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP mix </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Oligo (dT) 12-18 (0,5 mg / mL) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> DEPC tratados com água </td><td> mL n </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 10 ml </td></tr></tbody></table> Mesa mistura de reação 2. Para a etapa 5 da síntese de cDNA. Volumes indicados são por reação. Aumentar os volumes de cada componente para o número total de reações. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Tampão RT 10X </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl2 </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> 0,1 mM DTT </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> RNAseOUT </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TRIzol Reagent Manual. , (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNEasy Mini Handbook. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A fragilidade da molécula de RNA é o aspecto mais crítico que deve ser lembrado ao longo deste protocolo. Equipamento estéril que é RNAse-free deve ser sempre usada em uma zona livre de RNAse do laboratório. É útil reservar uma parte do laboratório a ser utilizado para procedimentos de RNA apenas. Esta área deve ser freqüentemente pulverizados com um produto de remoção de RNAse, como RNAse Away. As amostras de RNA devem ser sempre manuseadas com luvas e mantidos em gelo para evitar a degradação. <p cl...

<table><tbody><tr><td>Glycogen (5 mg/ml)</td><td>Ambion</td><td>9510</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pellet Pestles with Microfuge Tube</td><td>VWR international</td><td>KT749520-0090</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Light, 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>2302800</td><td></td></tr><tr><td>Phenol, Tris-saturated</td><td>Roche Group</td><td>3117944001</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>VWR international</td><td>17810-491</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-Free DNase Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNEasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript&amp;#174; First-Strand Synthesis System for RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>11904-018</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr></tbody></table>

rna isolation from embryonic zebrafish and cdna synthesis for gene expression analysis

Muitos procedimentos laboratoriais importantes e complexas exigem um trabalho de alta qualidade, RNA intacto. Uma amostra degradada ou a presença de impurezas pode levar a resultados desastrosos em downstream aplicações experimentais. É, portanto, de extrema importância o uso de técnicas sólidas com inúmeras salvaguardas e verificações de controle de qualidade para garantir uma amostra superior. Neste documento, detalhamos um protocolo para isolar RNA total a partir de embriões zebrafish inteiro usando um desnaturante químico comercialmente disponível e limpeza após a remoção de vestígios de DNA e impurezas através de um kit de isolamento comercial RNA. Como RNA é relativamente instável e facilmente propenso a clivagem pela RNAses, a maioria dos protocolos de expressão gênica de ensaio utilizando um produto que está diretamente cDNA sintetizado a partir de um modelo de RNA. Detalhamos um procedimento para converter RNA no produto mais estável cDNA usando um kit disponível comercialmente. Ao longo destes procedimentos, há inúmeros testes de qualidade de controlo para garantir que a amostra não é degradada ou contaminada. O produto final destes protocolos é cDNA que é adequado para análise de microarray, RT-PCR ou armazenamento de longo prazo.

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RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

O isolamento de alta qualidade, RNA intacto é um passo essencial para muitos protocolos laboratoriais. Aqui, demonstramos extração de RNA a partir de embriões zebrafish todo e síntese de cDNA para posterior aplicação em vários procedimentos experimentais, incluindo análise de microarray gene de expressão.

Isolamento de RNA Síntese Zebrafish e cDNA embrionárias para Análise de Expressão Gênica

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

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Research

JoVE Journal

Biology

37.9K visualizações.  Purdue University. O isolamento de alta qualidade, RNA intacto é um passo essencial para muitos protocolos laboratoriais. Aqui, demonstramos extração de RNA a partir de embriões zebrafish todo e síntese de cDNA para posterior aplicação em vários procedimentos experimentais, incluindo análise de microarray gene de expressão.

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Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

Em larga escala Zebrafish Embryonic Coração de dissecação para a análise transcricional

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Biologia do Desenvolvimento

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Genética

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Observando mitótico Division e Dinâmica em um embrião de peixe-zebra ao vivo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologia

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Análise da expressão global de Gene usando uma plataforma Microarray Zebrafish Oligonucleotide

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Neurociência

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

In Vivo Modelagem do Morbid Genoma Humano utilizando Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta resolução Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização dentro embriões Zebrafish para estudar a expressão gênica e função

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...