Parte 1: Extração de RNA total utilizando reagente Trizol Quando se trabalha com RNA é muito importante trabalhar em um ambiente que está livre de RNAses. Precauções simples, como ter pipetas reservados para uso apenas com os procedimentos de RNA e pulverizar a área de trabalho com um reagente descontaminante (por exemplo, RNAse Fora) antes de iniciar o procedimento são muito úteis. <ol><li> Para atingir uma quantidade suficiente de RNA piscina de 50 embriões zebrafish em um microtubo de 1,5 ml e remover tanta água quanto possível com uma pipeta. </li><li> Imediatamente adicione 250 mL de reagente Trizol 1 para o tubo de microcentrífuga contendo os embriões. Reagente Trizol contém fenol e só deve ser utilizado sob uma coifa. </li><li> Lyse e homogeneizar os embriões com um pilão pellet (aproximadamente 20 cursos) até que o tecido é suficientemente perturbada. </li><li> Quando as células são suficientemente homogeneizada, adicionar 750 mL de reagente TRIzol para igualar um volume total de 1 ml. </li><li> Para permitir a dissociação completa dos complexos de nucleoproteínas, incubar amostras homogeneizadas por 5 minutos em temperatura ambiente. Nesta fase, a amostra pode ser flash congelado em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ° C ou o protocolo pode ser continuado. </li><li> Para continuar a adicionar 0,2 ml de clorofórmio e agitar o tubo por 15 segundos para misturar. </li><li> Incubar a amostra por 2 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, centrifugar a 12.000 xg por 15 minutos a 4 ° C. </li><li> A mistura será separada em uma fase inferior fenol-clorofórmio vermelho, uma interfase, e uma fase superior aquosa incolor. A fase aquosa superior contém o RNA. A camada superior deve incluir cerca de 60% do volume inicial de TRIzol (aproximadamente 0,6 ml). Transferir a camada superior aquosa para um tubo de microcentrífuga novo usando uma pipeta de 1 ml com cuidado para não transferir qualquer da camada de interfase. </li><li> Para precipitar o RNA adicionar 0,5 ml de isopropanol. </li><li> Permitir que a amostra para sentar-se à temperatura ambiente por 10 minutos e, em seguida, centrifugar a amostra a 12.000 xg por 10 minutos a 4 ° C. RNA formará uma bolinha de gel na parte inferior do tubo. </li><li> Sem perturbar o sedimento, remover o sobrenadante com uma pipeta e lavar o sedimento em 1 ml de etanol 75%. Misturar a amostra por inversão e centrifugar a 7500 xg por 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Após a centrifugação, remover o etanol com uma pipeta e permitir a amostra seca ao mesmo tempo invertido por 10 minutos. </li><li> Ressuspender o sedimento, adicionando 100 ul de água livre de RNAse e incubar a amostra a 55 ° C por 10 minutos. Recomenda-se a dedo vortex freqüentemente durante a incubação para ajudar na reidratação RNA. Opcionalmente, você pode verificar a qualidade e quantidade de amostra usando um ND-1000 NanoDrop espectrofotômetro ou diretamente continuar para a próxima etapa. </li></ol> Parte 2: Limpeza de RNA usando o Qiagen RNEasy Mini Kit A Qiagen RNEasy Mini Kit 2 é útil na remoção de contaminantes e impurezas de uma amostra de RNA isolado de outros métodos. Para este procedimento, β-mercaptoetanol, etanol e água livre de nuclease são necessários além dos componentes incluídos no kit. Um tratamento DNAse opcional é recomendado durante este procedimento. <ol><li> Após a primeira utilização do kit, tampão RPE terá de ser preparado por adição de 4 volumes de etanol 100% para um volume de RPE Buffer. </li><li> No dia do procedimento, tampão RLT terá de ser preparada. Calcule a quantidade total de tampão RLT que serão necessários. Um volume de 350 mL é necessário por amostra. Para preparar RLT Buffer, adicione 10 ml de β-mercaptoetanol para cada 1 ml de buffer. Isto deve ser feito sob a coifa. </li><li> Para cada amostra adicionar 350 uL de tampão RLT e 250 mL de etanol a 100%. Misture bem, pipetando cima e para baixo várias vezes. </li><li> Transferir a amostra, que deve ser de aproximadamente 700 mL, em uma coluna RNEasy que é colocado em um tubo de coleta de 2 ml e centrifugar a 8.000 xg por 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Após centrifugação, descartar a fluir através de e adicione 700 mL de tampão RW1 a uma coluna de spin RNEasy. </li><li> Centrifugar a amostra a 8.000 xg por 1 minuto à temperatura ambiente e, em seguida, descartar a fluir. </li><li> DNAse tratamento com RNAse Qiagen-Free DNAse Kit: DNAse tratamento é opcional, mas é altamente recomendado para as amostras da mais alta qualidade. <ol style="list-style-type:upper-alpha;"><li> Quando você receber o kit de tratamento DNAse, você vai precisar para preparar a solução estoque DNAse I, adicionando água 550 mL nuclease-free para a DNAse. Misture delicadamente por inversão e não vortex. Alíquotas em frascos de utilização única contendo 10 ml da solução estoque. Você pode armazenar a solução estoque a -20 ° C por até 9 meses. As alíquotas descongeladas podem ser armazenadas a 4 ° C durante 6 semanas, se necessário, mas não voltar a congelar as alíquotas após o descongelamento. </li><li> Para preparar a mistura de incubação DNAse eu adicionar 70 mL de buffer RDD para 10 ml DNAse I stock solução por amostra. Misture por inversão suave e tubo de centrifugação rapidamente para recolher o líquido residual dos lados do tubo. Adicionar 80 mL DNAse mix de incubação eu diretamente para a coluna de spin RNEasy. Incubar o tratamento DNAse por 30 minutos em temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Tratamento DNAse seguir adicionar 350 mL de buffer RW1 para a coluna de spin e centrifugar a 8.000 xg por 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Após a centrifugação descartar a fluir através de e adicionar 500 mL de buffer RPE para a coluna de spin. Incubar amostra por 5 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar a 8.000 xg amostra por 1 minuto à temperatura ambiente e descarte a fluir. </li><li> Após a centrifugação adicionar 500 mL de etanol 75% para a coluna de spin. </li><li> Repetir a centrifugação a 8.000 xg, mas por 2 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Após a centrifugação descartar a fluir através de e permitir que a coluna para secar por 5 minutos. </li><li> Imediatamente centrífuga a 8.000 xg por 5 minutos em temperatura ambiente para remover qualquer sobra de vestígios de etanol. </li><li> Após a centrifugação é a transferência completa da coluna de spin em um novo tubo de coleta de 1,5 ml de água e adicionar 10 mL livre de nuclease. Incubar por 1 minuto e então centrifugar a 10.000 xg por 1 minuto à temperatura ambiente. O RNA será no fluir. </li><li> Adicionar outro mL 10 de água livre de nuclease para a coluna girar e incubar a temperatura ambiente por 1 minuto. Centrífuga de amostra a 10.000 xg por 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Após a centrifugação remover e descartar a coluna spin. RNA será no fluir. </li><li> Verificar a quantidade ea qualidade do RNA usando um espectrofotômetro ND-1000 NanoDrop seguindo as instruções do fabricante. </li><li> Além disso, executar um gel desnaturante ou usar um Agilent 2100 Bioanalyzer para verificar a integridade do RNA. </li><li> Amostras devem ser armazenadas a -80 ° C até a síntese de cDNA podem ser executadas. </li></ol> Parte 3: Síntese de cDNA usando a Invitrogen SuperScript Sistema First-Strand RNA é facilmente suscetível à clivagem pela RNAses levando à degradação. Como resultado protocolos expressão muitos gene têm sido desenvolvidos para usar um produto mais estável cDNA que foi diretamente sintetizado a partir do RNA. Aqui síntese detalhamos da vertente do primeiro cDNA usando a Invitrogen SuperScript Sistema de Síntese First Strand-3. Cada reação de síntese de cDNA pode acomodar até 5 mg de RNA. <ol><li> Antes de iniciar o procedimento de mistura e brevemente centrífuga cada componente. </li><li> Prepare RNA / mistura de primers num tubo de microcentrífuga estéril de 0,5 ml, conforme descrito na Tabela 1. </li><li> Incubar a amostra a 65 ° C por 5 minutos. </li><li> Imediatamente para transferir a pasta de gelo por 10 minutos. </li><li> Enquanto a amostra está esfriando preparar uma mistura principal com os componentes descritos na Tabela 2. Os volumes são listados por 1 reação. Ajustar volumes em conformidade, para o número total de reações. </li><li> Após o resfriamento, adicionar 9 mL da mistura principal preparada na etapa 5 para cada RNA / mistura primer. Misture delicadamente e recolher por centrifugação breve. O volume total de cada amostra deve ser de 19 mL. </li><li> Incubar amostra a 42 ° C por 2 minutos em um termociclador. </li><li> Adicionar 1 ml (50 unidades) de SuperScript II RT para cada tubo, misturar e incubar a 42 ° C por 60 minutos em um termociclador. </li><li> Finalizar a reação a 70 ° C por 15 minutos e depois relaxar amostra a 4 ° C. A termociclador pode ser programado para as etapas 8 e 9. </li><li> Depois de o provete ter atingido 4 ° C, transferir a reação a um banho de gelo. </li><li> No gelo adicionar 1 ml de RNAse H a cada tubo e incubar por 20 minutos a 37 ° C. O volume total é agora com 21 mL. Além de RNAse H para a amostra irá degradar o modelo de RNA e deixar apenas o produto único fio cDNA. </li></ol> Parte 4: Isolamento de cDNA e Precipitação <ol><li> Um tubo de 1,5 ml de fase gel bloqueio será utilizado no isolamento do produto cDNA. Prepare um tubo de 1,5 ml de fase gel bloqueio por centrifugação a 12.000 xg por 2 minutos. O gel deve ser todos no fundo do tubo. </li><li> Adicionar 81,5 mL de fenol (Tris-saturadas, tamponado a pH 8,0), 81,5 mL de álcool isoamílico 24:1 clorofórmio, e da amostra (21 mL) para o tubo de gel fase de bloqueio. Mix várias vezes por inversão suave. </li><li> Centrifugar a amostra a 12.000 xg por 5 minutos em temperatura ambiente. </li><li> O cDNA deve ser na fase aquosa superior. Transferir a fase superior para um tubo limpo de microcentrífuga de 1,5 ml. O volume total deve ser cerca de 20 mL. </li><li> Adicionar 1X volume de 3 M NaOAc, pH 5,2 e misture delicadamente. Por exemplo, se o volume da fase aquosa superior foi igual a 20 l, você terá que adicionar 2 l da 3 M NaOAc, pH 5.2. </li><li> Adicionar 7 mL de 5 glicogênio mg / ml e misture delicadamente. </li><li> Adicionar 1X volume de isopropanol e misture delicadamente. Geralmente isto é cerca de 30 mL de isopropanol. </li><li> Deixar a amostra para incubar a temperatur salae por 10 minutos e, em seguida, centrifugar a 12.000 xg por 20 minutos em temperatura ambiente. </li><li> A pelota pequena cDNA deve formar no fundo do tubo. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta. </li><li> Adicionar 500 mL de etanol 70% e misturar por inversão. </li><li> Centrifugar a amostra a 12.000 xg por 5 minutos. </li><li> Após a centrifugação remover o sobrenadante com uma pipeta e repita a lavagem de etanol 70% e centrifugação (etapas 10 e 11). </li><li> Após a centrifugação remover o sobrenadante com uma pipeta. Se houver líquido restante nas laterais do tubo, que podem ser reunidos por breves instantes, girando o tubo. Remova qualquer excesso de líquido e permitir que o pellet secar à temperatura ambiente por 5 minutos. </li><li> Adicionar 20 l de água livre de nuclease para reidratar o sedimento. Colocar a amostra a 55 ° C por 5 minutos para reidratação do sedimento. </li><li> A quantidade ea qualidade do produto cDNA é então verificada usando um espectrofotômetro ND-1000 NanoDrop seguindo as instruções do fabricante. O cDNA pode ser armazenado a -20 ° C. </li></ol> Resultados representante Após a limpeza RNA, cerca de 15 mg de RNA total de alta qualidade pode ser esperado de 50 embriões zebrafish. Para avaliar a qualidade do RNA total, um espectrofotômetro, eletroforese em gel, e um Agilent 2100 Bioanalyzer pode ser usado. A ND-1000 NanoDrop espectrofotômetro pode ser usado para avaliar a absorbância a 260 nm, em comparação com a absorvância a 280 nm (Figura 1). O A 260 / A 280 relação pode revelar a presença de contaminantes e dar indícios de degradação possível. Um A 260 / A 280 de 1,9-2,0 é considerada aceitável. Além disso, é altamente recomendável que um gel desnaturação RNA ser executado para avaliar a integridade do RNA. RNA vai separar em função do seu tamanho, com fios menores migrando mais para baixo do gel. A amostra não-degradada aparecerá como uma mancha com duas bandas fortes. O esfregaço é resultado de uma população de diferentes vertentes mRNA tamanho e as bandas correspondem a 28S e 18S rRNA. A banda 28S deve ser cerca de duas vezes tão intensa como a banda 18S (Figura 2). Alternativamente, a integridade do RNA total pode ser avaliada através de um Agilent 2100 Bioanalyzer. Dois picos distintos representando o rRNA 28S e 18S é esperado (Figura 3). O pico 28S deve ser maior do que o pico de 18S com a área sob os picos de aproximadamente 2:1, respectivamente. Dois picos distintos não será observada em amostras degradadas. Amostras de RNA exibindo degradação não deve ser feita através de procedimentos experimentais subseqüentes. Análise espectrofotométrica pode ser usado para avaliar a qualidade do produto cDNA (Figura 4). O A 260 / A 280 deve ser em torno de 1,8. reações cDNA com uma entrada de 5 mg de RNA total rotineiramente rendimento mg 1-2 de cDNA do produto em nosso laboratório. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Um espectro NanoDrop de amostra de RNA. Após a limpeza RNA, RNA quantidade e qualidade pode ser avaliada através de um ND-1000 NanoDrop espectrofotômetro. Aproximadamente 15 mg de alta qualidade total RNA é rotineiramente rendeu a partir de 50 embriões zebrafish com um A 260 / A 280 em torno de relação de 1,9-2,0. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Um gel desnaturação RNA. Para avaliar a integridade do isolamento do RNA total, um gel desnaturação RNA pode ser executado. Uma mancha com duas faixas brilhantes correspondente a 28S e 18S rRNA é esperado. A banda 28S deve ser de aproximadamente duas vezes mais intensa que a banda 18S. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Um traço de uma amostra de RNA a partir de um Bioanalyzer. Para avaliar a integridade do isolamento do RNA total, as amostras também podem ser analisados ​​em um Agilent 2100 Bioanalyzer. Dois picos, correspondentes aos 28S e 18S rRNA, deve ser visível. O pico 28S deve ser maior do que o pico de 18S com a área sob os picos de aproximadamente 2:1, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Um espectro NanoDrop de uma amostra de cDNA. Análise espectrofotométrica com um NanoDrop ND-1000 pode ser usado para avaliar a quantidade ea qualidade do produto cDNA. O A 260 / A 280 relação deve ser em torno de 1,8. reações cDNA com uma entrada de 5 ug de RNA total rotineiramente rendimento 1-2 ug de cDNA em nosso laboratório. Tabela 1. Componentes para adicionar para RNA / misturas de primer no passo 2 da síntese de cDNA. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Total de RNA (até 5 mg) </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP mix </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Oligo (dT) 12-18 (0,5 mg / mL) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> DEPC tratados com água </td><td> mL n </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 10 ml </td></tr></tbody></table> Mesa mistura de reação 2. Para a etapa 5 da síntese de cDNA. Volumes indicados são por reação. Aumentar os volumes de cada componente para o número total de reações. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Tampão RT 10X </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl2 </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> 0,1 mM DTT </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> RNAseOUT </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TRIzol Reagent Manual. , (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNEasy Mini Handbook. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A fragilidade da molécula de RNA é o aspecto mais crítico que deve ser lembrado ao longo deste protocolo. Equipamento estéril que é RNAse-free deve ser sempre usada em uma zona livre de RNAse do laboratório. É útil reservar uma parte do laboratório a ser utilizado para procedimentos de RNA apenas. Esta área deve ser freqüentemente pulverizados com um produto de remoção de RNAse, como RNAse Away. As amostras de RNA devem ser sempre manuseadas com luvas e mantidos em gelo para evitar a degradação. <p cl...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9510</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop ND-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>ND-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pellet Pestles with Microfuge Tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>KT749520-0090</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phase Lock Gel Light, 1.5 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>2302800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol, Tris-saturated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>3117944001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNAse Away</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>17810-491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNAse-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNEasy Mini Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&reg; First-Strand Synthesis System for RT-PCR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11904-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TRIzol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15596-026</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rna isolation from embryonic zebrafish and cdna synthesis for gene expression analysis

Muitos procedimentos laboratoriais importantes e complexas exigem um trabalho de alta qualidade, RNA intacto. Uma amostra degradada ou a presença de impurezas pode levar a resultados desastrosos em downstream aplicações experimentais. É, portanto, de extrema importância o uso de técnicas sólidas com inúmeras salvaguardas e verificações de controle de qualidade para garantir uma amostra superior. Neste documento, detalhamos um protocolo para isolar RNA total a partir de embriões zebrafish inteiro usando um desnaturante químico comercialmente disponível e limpeza após a remoção de vestígios de DNA e impurezas através de um kit de isolamento comercial RNA. Como RNA é relativamente instável e facilmente propenso a clivagem pela RNAses, a maioria dos protocolos de expressão gênica de ensaio utilizando um produto que está diretamente cDNA sintetizado a partir de um modelo de RNA. Detalhamos um procedimento para converter RNA no produto mais estável cDNA usando um kit disponível comercialmente. Ao longo destes procedimentos, há inúmeros testes de qualidade de controlo para garantir que a amostra não é degradada ou contaminada. O produto final destes protocolos é cDNA que é adequado para análise de microarray, RT-PCR ou armazenamento de longo prazo.

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RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

O isolamento de alta qualidade, RNA intacto é um passo essencial para muitos protocolos laboratoriais. Aqui, demonstramos extração de RNA a partir de embriões zebrafish todo e síntese de cDNA para posterior aplicação em vários procedimentos experimentais, incluindo análise de microarray gene de expressão.

Isolamento de RNA Síntese Zebrafish e cDNA embrionárias para Análise de Expressão Gênica

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

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Research

JoVE Journal

Biology

37.7K visualizações.  Purdue University. O isolamento de alta qualidade, RNA intacto é um passo essencial para muitos protocolos laboratoriais. Aqui, demonstramos extração de RNA a partir de embriões zebrafish todo e síntese de cDNA para posterior aplicação em vários procedimentos experimentais, incluindo análise de microarray gene de expressão.

Vídeo: RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biologia

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Análise da expressão global de Gene usando uma plataforma Microarray Zebrafish Oligonucleotide

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Isolamento e cultura de células da zona nefrogênica do rim do rato embrionárias

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

Marcação metabólica de RNA recém-transcrita para alta resolução Gene Expression Profiling de síntese de RNA, Processamento e Decay em cultura de células

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Análise de Desenvolvimento Embrionário e larval Zebrafish esqueléticos miofibras de Preparações dissociadas

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Isolamento à base de Afinidade de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos para Análise de Expressão Gênica

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

Targeted RNA Sequenciação Ensaio para Caracterizar expressão gênica e genômica Alterações

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...