A rotulagem, a hibridização, e protocolos de lavar aqui contêm algumas modificações para os desenvolvidos anteriormente pelo Dr. J. Quackenbush enquanto no The Institute for Genomic Research (TIGR), Dr. Shawn Levy no Microarray Vanderbilt Shared Resource (VMSR), e Dr. Rob Alba, enquanto no Boyce Thompson Institute (BTI) Cornell University.

(Nota Seções 1 - Não 4 demonstraram em Vídeo) Preparando Cy-alvo identificadas cDNA O que se segue é o protocolo que usamos para a síntese de cDNA a partir de RNA total de pinus taeda e rotulagem cDNA microarray indireta antes hibridizações. Apesar de alguns não-trivial modificações foram feitas, o protocolo abaixo é semelhante ao que no manual de instruções fornecido com o Kit Invitrogen de Etiquetagem SuperScript indireta cDNA. Parte 1: First-Strand reação de síntese de cDNA <ol><li> Misture e brevemente girar cada componente do kit antes de usar. </li><li> Prepare reacções como se segue: <ul><li> Xμl DEPC-H 2 O </li><li> Xμl total de RNA, 20 mg / reação (pré-tratados com DNase Turbo é Ambion) </li><li> Ancorado 2μl Oligo (dT) 20 Primer (2.5μg/μl) </li><li> Primer Hexamer 1μl Aleatório </li><li style="list-style:none;"> Volume Total = 18μl </li></ul></li><li> Incubar os tubos a 70 ° lugar C por 5 minutos, e depois em gelo durante 1-2 minutos. </li><li> Adicione o seguinte a cada tubo de reação sobre o gelo: <ul><li> 6μl tampão Strand-First 5X </li><li> 1.5μl 0,1 M DTT </li><li> 1.5μl 10mM dNTP mix </li><li> 1μl RNaseOUT (40U/μl) </li><li> 2μl SuperScript III RT (400U/μl) </li></ul></li><li> Misture delicadamente e girar rapidamente. Incube o tubo durante a noite a 45 ° C. </li><li> Adicionar 15μl de NaOH 1M para cada tubo de reacção e misture bem. </li><li> Incube o tubo a 70 ° C por 10 minutos. </li><li> Adicionar 15μl de 1M HCl; misture delicadamente. </li><li> Adicionar 20μl de acetato de sódio 3M (pH 5,2) e misturar delicadamente. </li></ol> Parte 2: Purificação de First-Strand cDNA. <ol><li> Adicionar 500μl de tampão de carregamento para o cDNA (a partir do Passo 1.9) e misturar bem. </li><li> Colocar uma coluna de purificação SNAP (fornecido com o kit Labeling indireta) em um tubo de coleta e carregar o seu cDNA na coluna. </li><li> Giram a 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto; descartar o escoamento. </li><li> Coloque a coluna no tubo SNAP mesma coleção e adicionar 500μl de tampão de lavagem. </li><li> Giram a 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto; descartar o escoamento. </li><li> Repita os passos 2.4 e 2.5 três vezes, para um total de três lavagens 500μl. </li><li> Girar mais uma vez a 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto seg; descartar o escoamento. </li><li> Coloque a coluna SNAP para um novo tubo de 1,5 ml. </li><li> Adicionar 50μl de água DEPC quente (50 ° C) para a Coluna SNAP e coluna incubar a temperatura ambiente por 1 minuto. Eluir o cDNA através de um giro em 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto. </li><li> Repita o passo 2.9, utilizando 100μl de água DEPC quente e mesmo tubo 1,5 ml do eluente. </li><li> Adicionar 20μl de acetato de sódio 3M (pH 5,2) para o eluente das etapas 2.9 e 2.10. </li><li> Adicionar 3μl de glicogênio (20mg/ml) para o tubo e misturar. </li><li> Adicionar 500μl de etanol gelado 100%, misture bem e incubar os tubos durante 1 hora a -80 ° C. </li><li> Girar o tubo a 14.000 g a 4 ° C por 20 minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante. </li><li> Adicionar 500μl de etanol gelado 70% e girar o tubo a 14.000 g a 4 ° C por 5 minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante. </li><li> Secar a amostra por 5 minutos; assegurar que todos os EtOH é removido. </li><li> Aquecer o tampão de acoplamento 2X a 37 ° C por 5 minutos e voltar a suspender a amostra cDNA em 5μl de tampão de acoplamento quente 2X. </li><li> Aqueça o buffer / cDNA Coupling a 50 ° C por 10 minutos e vortex bem. Garantir que o seu pellet cDNA é totalmente re-suspenso no buffer de acoplamento 2X. </li></ol> Parte 3: Rotulagem com corante fluorescente Ao preparar a reação, tenha cuidado para minimizar a exposição da solução de corante à luz. Além disso, DMSO é higroscópico e absorve a umidade do ar, que vai reagir com o éster NHS do corante e reduzir significativamente a eficiência da reação de acoplamento. Manter o DMSO fornecido no kit em um frasco com tampa de rosca âmbar a -20 ° C, e deixe o frasco à temperatura ambiente antes de abrir para evitar a condensação. Use apenas o DMSO fornecidos com este kit. <ol><li> Abra um pacote de Cy-3 ou Cy-5 Dye e adicionar 75μl de DMSO diretamente para o frasco do corante. </li><li> Adicionar 5μl da solução de DMSO / tintura para o tubo de Passo 2,18. </li><li> Misture bem e incubar os tubos em temperatura ambiente no escuro por uma hora. </li><li> Adicionar 20μl da 3M acetato de sódio (pH 5,2) para a solução corante-coupled cDNA. </li><li> Adicionar 500μl de tampão de carregamento para a solução de cDNA. Misture bem em vórtice. </li><li> Coloque uma coluna SNAP em um tubo de coleta clara e carregue a solução de cDNA / buffer. </li><li> Giram a 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto; descartar o escoamento. </li><li> Coloque a coluna SNAP na mesma coleçãotubo, adicionar 500μl de tampão de lavagem para a coluna. </li><li> Giram a 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto; descartar o escoamento. </li><li> Repita os passos 3. 8-3,9 três vezes, para um total de três lavagens 500μl. </li><li> Girar mais uma vez a 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto; descartar o escoamento. </li><li> Coloque a coluna SNAP para um novo tubo de recolha de âmbar. </li><li> Adicionar 65μl de água DEPC quente (50 ° C) para a Coluna SNAP e incubar à temperatura ambiente por 1 minuto. </li><li> Giram a 14.000 g à temperatura ambiente por 1 minuto e recolher o escoamento. O fluxo através deverá conter 60μl de sua purificada dye-coupled cDNA. </li></ol> Parte 4: Avaliar o procedimento de etiquetagem. <ol><li> Realizar um ensaio de espectrofotômetro para avaliar cada rotulagem Cy-cDNA. Calcular o número total de pmol de cDNA sintetizado: [OD 260 x vol. x 37ng/μl x 10 3 ng / pg] / 324,5 pg / pmol. Calcular o total de pmol incorporados Cy-Dye para cada reação rotulagem: pmol Cy3 = [OD 550 X vol.] / 0,15; pmol Cy5 = [OD 650 X vol.] / 0,25. Em seguida, calcular o pmol de nucleótidos / pmol relação de corante para cada reação. Reações ótima gerar&gt; 6000pmol de cDNA (por 60ul),&gt; 200pmol de Cy-Dye (por 60ul), e uma relação de nucleótidos / corante que é &lt;30. </li></ol> Parte 5: Slide de pré-lavagem <ol><li> O Array PtGen2 é impresso em slides Corning UltraGaps (amino-silano revestido) e cDNAs são UV-reticulado. Pontos de impressão são claramente visíveis devido ao alto teor de sal do buffer. </li><li> Use uma caneta de ponta de diamante para marcar o slide para as áreas superiores e inferiores da área de impressão (opcional). </li><li> Coloque cerca de 250mL pré-aquecido a 43 ° C 0,2% de solução SDS em microscópio de lavar prato de slides (3 &quot;x 4&quot;). </li><li> Colocar as lâminas de ser pré-hibridizada no rack de slides e mergulhe na solução de SDS 15-20 vezes muito vigorosamente para remover os sais nos slides. </li><li> Usando pinça, retire cuidadosamente os slides da prateleira e colocá-los em um frasco contendo tampão de hibridização Coplin Pré-(SSC 5X, SDS 0,1%, BSA 1%) que foi pré-aquecido a 43 ° C. Incubar a 43 ° C por pelo menos uma hora. </li></ol> Parte 6: Pré-hibridação <ol><li> Criar cinco pratos de slides de lavar roupa, cada uma preenchida com millipure dH 2 O, e um frasco cheio de Coplin molecular grau isopropanol. Colocar as lâminas em um rack de slides e processo sequencial através de cinco pratos com dunking 20 vezes cada. </li><li> Retirar as lâminas duas de cada vez a partir da lavagem com água e mergulhe quinta 5-6 vezes no lugar isopropanol e imediatamente em slides na microcentrífuga slide (de bancada Chipmate, 2 posições) e spin 1 minuto para secar. </li><li> Slides limpa com ar comprimido filtrado através de um cartucho de filtro de 0,22 mM e colocá-los com o código de barras virado para cima em uma Câmara Genomic Solutions hibridação. </li><li> LifterSlips Clean ™ com ar filtrado e posicioná-los nos slides com as tiras brancas voltada para baixo. Use a ponta da pipeta amarelo para alinhar suavemente o deslizamento levantador no slide (lavar LifterSlips ™ primeiro em etanol 70% é opcional. Descobrimos que ele seja desnecessário.) </li></ol> Parte 7: Hibridização Deve ser realizada à luz escura ou baixa. <ol><li> Para cada slide a ser hibridizado, calcular a quantidade de Cy-5 e Cy-3 rotulado cDNA para dar 50 75pmol de cada alvo. Combine os montantes em um único tubo e seca num exsicador de vácuo com a configuração de calor em 37-45 ° C. Evite secar completamente! </li><li> Volte a suspender as sondas secas em tampão de hibridação 60mL (feito fresco naquele dia) e brevemente vortex. </li><li> Incubar a cDNAs ressuspenso por 5 minutos em um banho de 95 ° C e depois de microcentrífuga rápida por 30 segundos. </li><li> Carregue o volume de sonda por toda ressuspenso lentamente na pipetagem o slide LifterSlip-junção ™ na parte inferior (fim do código de barras) do slide. O slide será carregado por meio de ação capilar. (Alguns preferem pipeta para o slide e então suavemente sobrepor a LifterSlip ™ este é um método um tiro, pois se você ficar bolhas você não pode mover o ™ LifterSlip após a colocação que pode levar a manchas local artefatos) </li><li> 20uL lugar de DTT 100mM em cada umidade bem localizado nas extremidades da câmara. </li><li> Coloque a parte superior da câmara e aperte os parafusos cam. Cobrir a câmara com folha de alumínio e mergulhe em um banho de água 48 ° C por 12-18 horas, com agitação suave a 50-60 rpm. </li></ol> Parte 8: Pós-hibridação Lava Todas as lavagens devem ser realizadas à luz escura ou baixa. Slides nunca deve ser deixada para secar até a etapa final. <ol><li> Criar um jar Coplin preenchido com solução de lavagem # 1 @ 53 ° C, e quatro pratos de slides de lavar cheia de 250mL de cada um dos seguintes: 1) Wash Solução # 1 @ 53 ° C, 2) Solução de Lavagem # 2 @ temperatura ambiente, 3 e 4) dois pratos contendo solução de lavagem # 3 @ temperatura ambiente. </li><li> Remova cuidadosamente os slides das câmaras de hibridação e coloque-os dois de uma vez dentro do frasco Coplin. Deixe descansar por 30 segundos, em seguida, levante a deslizar para fora lentamente e os slip levantador permanecerá na jarra. Colocar as lâminas em porta-lâminas e imediatamente mergulhe na solução de lavagem # 1 (1X SSC, 0,2% SDS, pré-aqueça a 43 ° C). Repita até que todos LifterSlips são removidos e todas as lâminas a serem lavadas na solução de lavagem # 1 prato. Mergulhe em rack cima e para baixo 10 vezes vigorosamente. </li><li> Coloque no prato de 53 ° C no ar shaker com agitação 50-100 rpm em 10 minutos. </li><li> Transferência de rack para Solução de lavagem # 2 (0,1 x SSC, 0,2% SDS), mergulhe 10 vezes, e incubar à temperatura ambiente, lenta agitação por 10 minutos. </li><li> Dip em rack de 15 vezes para a solução de lavagem primeira # 3 (0,1 x SSC) para remover qualquer SDS residual transitar de Solução de Lavagem # 2. Rack de lugar na solução de lavagem segunda # 3 prato, mergulhar 10 vezes, e em seguida lenta agitação por 10 minutos. </li><li> Colocar as lâminas em 50 mL tubos Falcon nivelado e girar @ 1.500 rpm em centrífuga equipado com um rotor de caçamba móvel. Retirar as lâminas à luz recipiente à prova, usamos um outro tubo de Falcon coberto com papel alumínio e ar de purga do tubo com gás nitrogênio, tampa bem (o que reduz a oxidação dos corantes Cy, especialmente Cy-5 no verão, quando os níveis de ozônio são mais elevados ). Lâminas podem ser armazenadas por algumas horas antes da digitalização nos tubos de nitrogênio purgado, no entanto, melhores resultados são obtidos quando sinal de digitalização é feito imediatamente após a lavagem. </li></ol> Parte 9: Coleta de Dados e Análise Estatística <ol><li> Dados de imagem de verificação é recolhida em um ScanArray PerkinElmer. Nós usamos uma configuração de digitalização de 10 micra e equilíbrio Cy3 e Cy5 sinais utilizando o método de ajuste da linha de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> TIF são grade e dados de sinal primas coletadas e filtradas com ImaGene Versão 7.5 (Biodiscovery, Inc., El Segundo, CA) </li><li> Normalização de dados e avaliação para determinar estatisticamente espécie válida diferencialmente expressos é feito com ferramentas de matriz BRB Ver. 3.7. </li><li> Análise de padrões para facilitar a determinação de genes expressos coordenadamente é feito com Gene Software Análise de Expressão de Padrão (GEPAS) Ver. 3.1. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1182/Figure1_WWLorenz-1.png" alt="Figura 1" /> Figura 1. Exemplo de PtGen2 série processados ​​usando este l. Protoco <img src="/files/ftp_upload/1182/Figure2_WWLorenz.png" alt="Figura 2" /> Figura 2. Exemplo de PtGen2 série processados ​​usando hibridização e protocolos padrão de lavar roupa.

<ol>
	<li>Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+stress-responsive+genes+in+loblolly+pine+(Pinus+taeda)+roots+identified+by+analyses+of+expressed+sequence+tag+libraries.">Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries.</a> Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).</li><li>Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> unpublished data. , .</li><li>Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+concise+guide+to+cDNA+microarray+analysis.">A concise guide to cDNA microarray analysis.</a> Biotechniques. 29, 548-562 (2000).</li><li>Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESTs,+cDNA+microarrays,+and+gene+expression+profiling:+tools+for+dissecting+plant+physiology+and+development.">ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development.</a> The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).</li><li>Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Gene+Expression+changes+in+Pinus+species+using+a+Loblolly+pine+cDNA+microarray.">Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray.</a> IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. , (2008).</li><li>Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+during+P.+pinaster+embryo+development.">Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development.</a> 7th Plant Genomics European Meeting. , (2008).</li></ol>

PtGen2 é um recentemente desenvolvido, personalizado microarray de cDNA, que foi projetado para ser usado principalmente pela comunidade de pesquisa loblolly pinho. Os resultados preliminares gerados até o momento têm demonstrado a matriz para ser uma ferramenta valiosa na avaliação de eventos transcricionais que ocorrem em resposta ao estresse hídrico, bem como no monitoramento das mudanças que ocorrem durante o desenvolvimento do embrião no pinheiro bravo, Pinus pinaster 5,6 Temos também d...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pre-hybridization Buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization Buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt&#x2019;s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #1</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #2</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.1X SSC, 0.2% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Wash Solution #3</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.1X SSC</td>
</tr>
<tr>
<td>Isopropyl Alcohol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>34959-2.5L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50mL Conical Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Falcon&#x2122;</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15mL Conical Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Falcon&#x2122;</td>
<td>352196</td>
<td>Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation</td>
</tr>
<tr>
<td>Coplin Jar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wheaton&#x2122;</td>
<td>900520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Dish & Rack </td>
<td>Other</td>
<td>Wheaton&#x2122;</td>
<td>900200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
<td>Other</td>
<td>Sigma&#x2122;</td>
<td>A-9418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PolyA RNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen&#x2122;</td>
<td>POLYA.GF</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling </td>
<td>Kit</td>
<td>Invitrogen&#x2122;</td>
<td>L1014-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Turbo DNase</td>
<td>Kit</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1907</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-5 Dye</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE&#x2122;</td>
<td>PA25001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy-3 Dye</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE&#x2122;</td>
<td>PA23001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LifterSlips&trade;</td>
<td>Other</td>
<td>Erie Scientific Company&#x2122; </td>
<td>25X601</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HybChambers</td>
<td>Equipment</td>
<td>GeneMachines</td>
<td>JHYB200003</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

processing the loblolly pine ptgen2 cdna microarray

PtGen2 é um microarray de cDNA contendo funcionalidade 26.496 ESTs pinheiros loblolly amplificada. A matriz é produzido em nosso laboratório a ser utilizado por pesquisadores que estudam a expressão gênica em espécies de coníferas de pinheiros e outras. PtGen2 foi desenvolvido como resultado de nossos esforços gene descoberta em pinheiro, e é composta de seqüências identificadas principalmente a partir de tecidos de raiz, mas também de agulha e tronco 1,2. PtGen2 foi testado por hibridação diferentes Cy dye-rotulados cDNAs alvo de coníferas , usando tanto amplificadas e não amplificadas métodos de rotulagem indireta, e também testados com uma série de condições de hibridização e lavagem. Este vídeo enfoca a manipulação e processamento de slides antes e após a pré-hibridização, bem como após a hibridização, utilizando-se algumas modificações para os procedimentos desenvolvidos anteriormente 3,4. Também estão incluídos, em forma de texto único, são os protocolos utilizados para a geração, rotulagem e limpeza de cDNA s alvo, bem como informações sobre o software usado para processamento de dados a jusante. PtGen2 é impresso com um buffer de impressão proprietária que contém altas concentrações de sal que pode ser difícil de remover completamente. As lâminas são lavadas primeiro em uma solução SDS quente antes de pré-hibridização. Após a pré-hibridização, as lâminas são lavadas vigorosamente em várias mudanças de água para completar a remoção dos sais remanescentes. LifterSlips ™ são limpos e, em seguida, posicionado na slides e rotulado cDNA é cuidadosamente carregado no microarray por meio de ação capilar que prevê a distribuição uniforme da amostra em todo o slide, e reduz a chance de incorporação de espuma. Hibridação de metas para a matriz é feita a 48 ° C em condições de alta umidade. Após a hibridização, uma série de lavagens padrão são feitas a 53 ° C e temperatura ambiente por longos períodos. Processamento PtGen2 slides usando esta técnica reduz o sal ea SDS-artefatos derivados muitas vezes visto quando a matriz é processada menos rigorosa. Hibridação alvos derivado de várias fontes diferentes de coníferas RNA, este protocolo de processamento rendeu menos artefatos, fundo reduzida, e desde uma maior consistência entre os diferentes grupos experimentais de matrizes.

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Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

O cDNA microarray PtGen2 foi desenvolvido para estudos de expressão gênica em mudas de pinus,<em&gt; P. taeda</em&gt;, E outras espécies de coníferas. Aqui, vamos mostrar pré e pós-hibridação manuseio e técnicas de lavagem que pode ser usado com esta matriz para produzir uma maior consistência, artefatos reduzida, e fundos mais baixos.

Processamento do Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

processing-the-loblolly-pine-ptgen2-cdna-microarray

Research

JoVE Journal

Biology

7.3K visualizações.  University of Georgia (UGA). O cDNA microarray PtGen2 foi desenvolvido para estudos de expressão gênica em mudas de pinus, P. taeda, E outras espécies de coníferas. Aqui, vamos mostrar pré e pós-hibridação manuseio e técnicas de lavagem que pode ser usado com esta matriz para produzir uma maior consistência, artefatos reduzida, e fundos mais baixos.

Vídeo: Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain quality. F. graminearum also causes stalk and ear rots of maize and is a producer of mycotoxins such as the trichothecenes that contaminate grain and are harmful to humans and livestock (Goswami and Kistler, 2004).

The fungus produces two types of spores. Ascospores, the propagules resulting from sexual reproduction, are the main source of primary infection.  These spores are forcibly discharged from mature perithecia and dispersed by wind (Francl et al 1999). Secondary infections are mainly caused by macroconidia which are produced by asexual means on the plant surface. To study the developmental processes of ascospores in this fungus, a procedure for their collection in large quantity under sterile conditions was required. Our protocol was filmed in order to generate the highest level of information for understanding and reproducibility; crucial aspects when full genome gene expression profiles are generated and interpreted. In particular, the variability of ascospore germination and biological activity are dependent on the prior manipulation of the material. The use of video for documenting every step in ascospore production is proposed in order to increase standardization, complying with the increasingly stringent requirements for microarray analysis. The procedure requires only standard laboratory equipment. Steps are shown to prevent contamination and favor time synchronization of ascospores.

To study the developmental processes of ascospores in Gibberella zeae, a procedure for collection under sterile conditions is filmed in order to generate the highest level of information for protocol description. This should facilitate the reproducibility of the experiment, a crucial aspect when full genome expression profile tests are implemented.

Gibberella zeae produção de ascósporos e Coleta de Experimentos de Microarray.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

Biologia

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. Microfluidics is commonly associated with closed microchannels which limit their use to samples that can be introduced, and cultured in the case of cells, within a confined volume. On the other hand, micropipetting system have been used to locally perfuse cells and surfaces, notably using push-pull setups where one pipette acts as source and the other one as sink, but the confinement of the flow is difficult in three dimensions. Furthermore, pipettes are fragile and difficult to position and hence are used in static configuration only. 
The microfluidic probe (MFP) circumvents the constraints imposed by the construction of closed microfluidic channels and instead of enclosing the sample into the microfluidic system, the microfluidic flow can be directly delivered onto the sample, and scanned across the sample, using the MFP. . The injection and aspiration openings are located within a few tens of micrometers of one another so that a microjet injected into the gap is confined by the hydrodynamic forces of the surrounding liquid and entirely aspirated back into the other opening. The microjet can be flushed across the substrate surface and provides a precise tool for localized deposition/delivery of reagents which can be used over large areas by scanning the probe across the surface. 
In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer.

In this video we present the microfluidic probe1 (MFP). We explain in detail how to assemble the MFP, mount it atop an inverted microscope, and align it relative to the substrate surface, and finally show how to use it to process a substrate surface immersed in a buffer solution.

O Probe microfluídicos: Operação e Uso de Processamento de Superfície localizada

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Isolamento de RNA Síntese Zebrafish e cDNA embrionárias para Análise de Expressão Gênica

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Análise da expressão global de Gene usando uma plataforma Microarray Zebrafish Oligonucleotide

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

A microfluídica digital para processamento automatizado Proteômica

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine (P. taeda L.) and Other Conifer Species

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high concentrations of phenolic compounds and polysaccharides that interfere with RNA purification. Isolation of high-quality RNA from these species requires rigorous tissue collection procedures in the field and the employment of an RNA isolation protocol comprised of multiple organic extraction steps in order to isolate RNA of sufficient quality for microarray and other genomic analyses. The isolation of high-quality RNA from field-collected loblolly pine samples can be challenging, but several modifications to standard tissue and RNA isolation procedures greatly improve results. The extent of general RNA degradation increases if samples are not properly collected and transported from the field, especially during large-scale harvests. Total RNA yields can be increased significantly by pulverizing samples in a liquid nitrogen freezer mill prior to RNA isolation, especially when samples come from woody tissues. This is primarily due to the presence of oxidizing agents, such as phenolic compounds, and polysaccharides that are both present at high levels in extracts from the woody tissues of most conifer species. If not removed, these contaminants can carry over leading to problems, such as RNA degradation, that result in low yields and a poor quality RNA sample. Carryover of phenolic compounds, as well as polysaccharides, can also reduce or even completely eliminate the activity of reverse transcriptase or other polymerases commonly used for cDNA synthesis. In particular, RNA destined to be used as template for double-stranded cDNA synthesis in the generation of cDNA libraries, single-stranded cDNA synthesis for PCR or qPCR's, or for the synthesis of microarray target materials must be of the highest quality if researchers expect to obtain optimal results. RNA isolation techniques commonly employed for many other plant species are often insufficient in their ability to remove these contaminants from conifer samples and thus do not yield total RNA samples suitable for downstream manipulations. In this video we demonstrate methods for field collection of conifer tissues, beginning with the felling of a forty year-old tree, to the harvesting of phloem, secondary xylem, and reaction wood xylem. We also demonstrate an RNA isolation protocol that has consistently yielded high-quality RNA for subsequent enzymatic manipulations.

An Improved Method of RNA Isolation from Loblolly Pine P. taeda L. and Other Conifer Species

Many plant tissues, including phloem and xylem from loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high levels of phenolics and polysaccharides that interfere with RNA purification. This presentation discusses techniques for the harvest of field-grown tissues and isolation of RNA of sufficient quality for microarrays and other genomic analyses.

Um método melhorado de isolamento de RNA Pine Loblolly ( P. taeda L.) e espécies de coníferas Outros

Tissues isolated from conifer species, particularly those belonging to the Pinaceae family, such as loblolly pine (Pinus taeda L.), contain high ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1. Complex genomes encode at least hundreds of miRNAs, which primarily inhibit the expression of a vast number of target genes post-transcriptionally 2, 3. miRNAs control a broad range of biological processes 1. In addition, altered miRNA expression has been associated with human diseases such as cancers, and miRNAs may serve as biomarkers for diseases and prognosis 4, 5. It is important, therefore, to understand the expression and functions of miRNAs under many different conditions.
Three major approaches have been employed to profile miRNA expression: real-time PCR, microarray, and deep sequencing. The technique of miRNA microarray has the advantage of being high-throughput, generally less expensive, and most of the experimental and analysis steps can be carried out in a molecular biology laboratory at most universities, medical schools and associated hospitals. Here, we describe a method for performing custom miRNA microarray experiments. A miRNA probe set will be printed on glass slides to produce miRNA microarrays. RNA is isolated using a method or reagent that preserves small RNA species, and then labeled with a fluorescence dye. As a control, reference DNA oligonucleotides corresponding to a subset of miRNAs are also labeled with a different fluorescence dye. The reference DNA will serve to demonstrate the quality of the slide and hybridization and will also be used for data normalization. The RNA and DNA are mixed and hybridized to a microarray slide containing probes for most of the miRNAs in the database. After washing, the slide is scanned to obtain images, and intensities of the individual spots quantified. These raw signals will be further processed and analyzed as the expression data of the corresponding miRNAs. Microarray slides can be stripped and regenerated to reduce the cost of microarrays and to enhance the consistency of microarray experiments. The same principles and procedures are applicable to other types of custom microarray experiments.

A simple procedure of performing custom microRNA microarray experiments is described. The steps include isolating RNA, labeling RNA and reference DNA, hybridizing the samples to microarrays, scanning the microarrays, quantifying and analyzing hybridization signals.

A realização de experimentos de Microarray personalizado MicroRNA

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

A major approach in the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of genes of interest in selected cell lines, with the aim to reveal one or several of the gene's function(s) using transient/stable overexpression or knockdown of the gene of interest. Unfortunately, for various cell biological investigations this approach is unsuitable when manipulations of gene expression result in cell growth/proliferation defects or unwanted cell differentiation. Therefore, researchers have adapted the Tetracycline repressor protein (TetR), taken from the E. coli tetracycline resistance operon1, to generate very efficient and tight regulatory systems to express cDNAs in mammalian cells2,3. In short, TetR has been modified to either (1) block initiation of transcription by binding to the Tet-operator (TO) in the promoter region upon addition of tetracycline (termed Tet-off system) or (2) bind to the TO in the absence of tetracycline (termed Tet-on system) (Figure 1). Given the inconvenience that the Tet-off system requires the continuous presence of tetracycline (which has a half-life of about 24 hr in tissue cell culture medium) the Tet-on system has been more extensively optimized, resulting in the development of very tight and efficient vector systems for cDNA expression as used here.
Shortly after establishment of RNA interference (RNAi) for gene knockdown in mammalian cells4, vectors expressing short-hairpin RNAs (shRNAs) were described that function very similar to siRNAs5-11. However, these shRNA-mediated knockdown approaches have the same limitation as conventional knockout strategies, since stable depletion is not feasible when gene targets are essential for cellular survival. To overcome this limitation, van de Wetering et al.12 modified the shRNA expression vector pSUPER5 by inserting a TO in the promoter region, which enabled them to generate stable cell lines with tetracycline-inducible depletion of their target genes of interest.
Here, we describe a method to efficiently generate stable human Tet-on cell lines that reliably drive either inducible overexpression or depletion of the gene of interest. Using this method, we have successfully generated Tet-on cell lines which significantly facilitated the analysis of the MST/hMOB/NDR cascade in centrosome13,14 and apoptosis signaling15,16. In this report, we describe our vectors of choice, in addition to describing the two consecutive manipulation steps that are necessary to efficiently generate human Tet-on cell lines (Figure 2). Moreover, besides outlining a protocol for the generation of human Tet-on cell lines, we will discuss critical aspects regarding the technical procedures and the characterization of Tet-on cells.

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

A rapid and simple way to generate human cell lines with inducible and reversible cDNA overexpression or shRNA-mediated knock-down of the gene of interest. This method enables researchers to reliably and highly reproducibly manipulate cell lines that are difficult to alter by transient transfection methods or conventional knockdown/knockout strategies.

A geração de linhas de células humanas estáveis ​​com tetraciclina induzível (Tet-on) ou shRNA Expression cDNA

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes precursor mRNA beyond the end of mature RNAs, and an active process of endonuclease activity is required at a specific site. Cleavage of the precursor RNA normally occurs 10-30 nt downstream from the consensus polyA site (AAUAAA) after the CA dinucleotides. Proteins from the cleavage complex, a multifactorial protein complex of approximately 800 kDa, accomplish this specific nuclease activity. Specific RNA sequences upstream and downstream of the polyA site control the recruitment of the cleavage complex. Immediately after cleavage, pre-mRNAs are polyadenylated by the polyA polymerase (PAP) to produce mature stable RNA messages.
Processing of the 3&#8217; end of an RNA transcript may be studied using cellular nuclear extracts with specific radiolabeled RNA substrates. In sum, a long 32P-labeled uncleaved precursor RNA is incubated with nuclear extracts in vitro, and cleavage is assessed by gel electrophoresis and autoradiography. When proper cleavage occurs, a shorter 5&#8217; cleaved product is detected and quantified. Here, we describe the cleavage assay in detail using, as an example, the 3&#8217; end processing of HIV-1 mRNAs.

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

RNA polymerase II synthesizes a precursor RNA that extends beyond the 3' end of the mature mRNA. The end of the mature RNA is generated cotranscriptionally, at a site dictated by RNA sequences, via the endonuclease activity of the cleavage complex. Here, we detail the method to study cleavage reactions in vitro.

Processamento do Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Gibberella zeae produção de ascósporos e Coleta de Experimentos de Microarray.

O Probe microfluídicos: Operação e Uso de Processamento de Superfície localizada

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A microfluídica digital para processamento automatizado Proteômica

Um método melhorado de isolamento de RNA Pine Loblolly ( P. taeda L.) e espécies de coníferas Outros

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

A realização de experimentos de Microarray personalizado MicroRNA

A geração de linhas de células humanas estáveis com tetraciclina induzível (Tet-on) ou shRNA Expression cDNA

Análise das reacções de processamento de RNA utilizando células Sistemas gratuitas: 3 'Fim de clivagem de pré-mRNA Substratos

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