Os autores gostariam de agradecer os membros do laboratório de Houston para a leitura crítica do manuscrito. Pesquisa é apoiada pelo National Institutes of Health (GM083999) concedido a DWH

1. Remoção cirúrgica do tecido do ovário <ol class="lalpha"><li> Prepare um novo lote de meio de cultura de oócitos (OCM; Materials), entre 400-800 mL, dependendo do tamanho do experimento. Ajustar o pH a 7,6-7,8, até que o vermelho de fenol tem uma cor vermelho escuro (seis ou mais pequenas gotas de 5N NaOH). Derramar uma pequena quantidade para verificar o pH em um tubo separado desde o eletrodo de pH pode contaminar os meios de comunicação. OCM deve ser armazenado a 18 ° C e utilizada dentro de uma semana. </li><li> Selecione 3-5 fêmeas e um lugar em ~ 2L solução anestésica buffered (Materiais). Tentamos evitar o uso de rãs que foram alimentadas no dia ou antes da cirurgia. Enquanto o sapo é sucumbir ao anestésico, desinfetar a área cirúrgica com EtOH 70% e preparar os instrumentos cirúrgicos. </li><li> Esterilizar os instrumentos cirúrgicos por 20 segundos de imersão em um esterilizador quente talão a 250 ° C. Os seguintes instrumentos devem estar na mão: lidar com bisturi (# 3) e lâmina (# 10 ou 11), vários pares de fórceps Dumont, íris Bonn tesouras (curvo ou reto), Halsey ou Olsen-Hegar porta-agulha micro, e suturas. Coloque instrumentos esterilizados em uma placa de Petri estéril ou no interior da embalagem de sutura para manter estéril. Segure a agulha no suporte da agulha na orientação desejada antes de começar. Nós preferimos titulares Olsen-Hegar agulha desde a alça contém lâminas da tesoura, que pode ser usado para cortar suturas sem instrumentos de comutação. </li><li> Após 10 minutos, verificar se um plano cirúrgico de anestesia foi alcançado. Rãs anestesiados vai parar de se mover e não responder a uma pitada dedo do pé ou sendo entregues. Anestesia deve durar 15 minutos, que é tempo mais que suficiente para realizar as operações. Don traje cirúrgico adequado. Isso pode incluir luvas limpas (não-látex), jalecos de laboratório, e máscaras cirúrgicas, dependendo da preferência pessoal e diretrizes de atendimento institucional animal. </li><li> Nota sobre a técnica asséptica: secreções da pele da rã contém peptídeos antimicrobianos, que geralmente reduzir a incidência de contaminação durante a cirurgia, apesar de uma técnica asséptica deve ser seguido, tanto quanto possível. Campos cirúrgicos podem ser usados, mas não pode ser exigido por IACUCs institucional e não pode fornecer muito benefício. Geralmente &quot;técnica de ponta&quot; utilizado, onde as mãos se tocam as pontas estéril do material de sutura instrumentos, ou local da incisão. Instrumentos podem ser reesterilizado (no esterilizador bead) após a incisão da pele, e uma área estéril deve ser mantido na bancada para a colocação de instrumentos (como uma placa de Petri ou pacote de sutura). Requisitos institucionais podem diferir significativamente, então por favor, seguir as orientações suas instituições &quot;e receber instruções apropriadas antes de cirurgias desempenho. </li><li> Remova o sapo de anestésico local e em decúbito dorsal em uma cirurgia úmido wipe. Nota. A pele podem ser limpos por lavagem de iodo povidine diluído (1:20) ou clorexidina (0,75%). No entanto, evite comercial esfrega cirúrgico, sabonetes e 70% de álcool isopropílico, que podem danificar a delicada pele de anfíbios. </li><li> Usando uma tesoura pequena bisturi ou íris, fazer uma (1-1,5 cm) pequena incisão na pele na parte inferior do abdômen, lateral à linha média. Incisões posteriores sobre o sapo mesma deve ser realizada em lados alternados, bem espaçadas umas das outras. Incisões podem ser feitas em paralelo ou perpendicular à linha média. </li><li> Fazer incisões na pele e músculo abdominal em duas etapas. Depois de cortar a pele, levante a camada muscular e ao redor fascia de cor branca com uma pinça e fazer a incisão no músculo levantadas. Use uma tesoura e corte reto para baixo, tentar fazer um corte rápido para expor a cavidade do corpo deixando bordas da ferida limpa. Se apenas a fascia é cortado, ele será recolhido e vai fazer sutura mais difícil. Levantar o músculo irá ajudar a evitar inadvertidamente ferir qualquer dos órgãos internos. Além disso, tentar evitar o corte através de qualquer corações linfáticos ou vasos sangüíneos visíveis dentro das camadas musculares. Estender o comprimento com a tesoura da incisão, para que o ovário pode ser facilmente puxado através. </li><li> Ovário devem ser claramente visíveis uma vez que a incisão é feita. Para adquirir o ovário, segure com uma pinça e exteriorizar o tecido do ovário. A quantidade desejada de tecido é removido e cortado fora no nível da parede do corpo. Não encha o tecido de volta para dentro da cavidade celomática, como isso poderia ser uma fonte de infecção ou outras complicações. </li><li> Imediatamente observar um pequeno pedaço de ovário sob um microscópio de dissecação e um oócitos defolliculate alguns para testar sua qualidade. Eles devem ser firmes e de tamanho uniforme e coloração. Se eles são aceitáveis, retire a quantidade desejada de tecido de ovário e sutura da incisão. Suficiente para encher uma placa de Petri 90 milímetros é geralmente suficiente para a maioria dos experimentos. Se os ovócitos são de qualidade questionável, sutura o sapo e repita com uma mulher diferente. </li><li> Fechar a incisão com sutura da fascia muscular e camada de primeira. Insira o n<html> eedle alguns milímetros lateralmente à incisão, certificando-se de passagem através da camada de fáscia também. Suturas apenas através do músculo pode rasgar o tecido e se soltar. Use uma pinça para ajudar a inserir a agulha de baixo para cima no lado oposto da incisão. Liberação e re-entender a agulha de fora do corpo e puxe o fio através de até vários centímetros, mais ou menos da cauda permanece, tomando cuidado para não puxá-lo todo o caminho. </li><li> Fechar a ferida com um padrão simples interrompido de sutura. Usamos um empate instrumento básico para fazer nós quadrados cirurgião (nós reef). Ciclo final longo da sutura em torno do suporte da agulha, segure a cauda e puxe-o através do loop para você e aperte. Laço e puxe através de novo, desta vez puxe o suporte da agulha para longe de você. Um lance terceiro pode ser usado para aumentar a segurança (na mesma direção que o primeiro). Guarnição da sutura, deixando cauda curta e fazer outra sutura no músculo alguns milímetros de distância. Dois pontos são suficientes para pequenas suturas, três para os maiores. Repita o procedimento para a camada de pele. Demonstrações em vídeo de técnica de sutura básicas estão disponíveis no YouTube - procurar por &quot;tie instrumento&quot;, há muito poucos para escolher, embora a técnica básica é a mesma. </li><li> Enxaguar a fêmea com água deionizada e colocá-la em um balde cheio de recuperação cool (18 ° C) de água. Enquanto no laboratório, os sapos são mantidos em água de torneira tratada com Amquel para remover cloraminas. A cada poucos minutos, levante cuidadosamente o sapo da água e olhar para engolir ou olhos esbugalhados movimentos, indicativo de recuperação da anestesia. </li><li> Nota: A cirurgia de sobrevivência não é estritamente necessário para a obtenção de tecido do ovário, embora as fêmeas continuarão a produzir ovócitos depois de um bom número de operações. Realizar a cirurgia de sobrevivência também vai reduzir o número de animais utilizados. Certifique-se de seguir as diretrizes da unidade de cuidados dos animais nos métodos de sobrevivência vertebrados cirurgia, cuidados pós-operatório e monitoramento e para o número de cirurgias permitido em um indivíduo. </li></ol> 2. Cultura e Oócitos Defolliculating <ol class="lalpha"><li> Logo após a cirurgia terminar, subdividir o ovário em pedaços pequenos (~ 2 cm 2) e armazenar em OCM fresca, usando 5-6 peças por 90 prato mm. Lóbulos individuais de ovário são cortados, achatada e corte em pedaços quadrados. Estes são lavados no OCM limpo e colocado em pratos de cultura. Achatamento e dividindo-se o ovário irá prolongar a sua vida na cultura e fazer defolliculation mais fácil. </li><li> Mover um lobo a um pequeno prato de OCM e manualmente defolliculate 300-500 oócitos. Ovócitos transferência usando um estéril, pipeta-fogo polido. Nós descobrimos que o uso da variedade de algodão-ligado é essencial para minimizar a contaminação das culturas. Armazenar os ovócitos a 18 ° C em 8 mL OCM (em pratos médio (Falcon 1007)) em grupos de 100-150. Com a prática, você deve ser capaz de defolliculate ovócitos o suficiente em 1-2 horas. Oócitos Collagenased não são adequados para transferência de host, uma vez que não são ser fertilizado. </li><li> Defolliculating método. Nós defolliculate usando relojoeiros &#39;fórceps (Dumont # 4s ou 5s #, Ferramentas Ciência Fine), seguindo os métodos básicos descritos no Smith et al., (1991). Usando um par de fórceps (em sua mão dominante), segure a theca camada de tecido conjuntivo em torno de um totalmente crescido oócito VI palco perto de onde o folículo está ligado ao ovário (o talo). Com o outro par de fórceps, segure o ovário adjacente ao primeiro par. Levemente rasgar a camada folículo, puxando todo o ovócito. Suavemente provocar o ovócito fora do tecido. Oócitos com sucesso defolliculated são floppier de oócitos simplesmente puxado para fora sem remover a camada de folículo e será desprovida de vasos sanguíneos visíveis. </li><li> Nota: É essencial para manter a pressão muito leve na ponta da pinça, apenas o suficiente para as pontas para atender. Agarrando com muita força é um comum entre os iniciantes e resultará no oócito a ser afastada com o folículo intacto. Manter um bom par de fórceps exclusivamente para defolliculating. As pontas devem atender de forma precisa e deve ser um pouco mais direto do que uma pinça para a tomada de explantes de embriões Xenopus (Figura 1). </li><li> Rotineiramente teste madura sobre 20 com progesterona e abortar o experimento se a taxa de maturação é pobre (&lt;50% após 6-7 horas à temperatura ambiente). </li><li> Neste ponto, os oócitos podem ser manipuladas e cultivadas como desejado, como microinjeção de oligo, morfolino ou mRNA. Procedimentos de injeção variam de acordo com laboratório, por isso não vamos descrever aqueles aqui. Oócitos podem ser mantidos até uma semana na OCM, mas geralmente a saúde declina por isso é melhor usá-los para transferência no prazo de 96 horas de isolamento. </li><li> Tenha em mente que apenas cinco a seis grupos (incluindo um controle) pode ser transferido para uma única fêmea, devido a limitações de corantes vitais, de modo plano seus experimentos em conformidade. </li></ol>&quot;Maturação&gt; 3. Oócitos e Estimulação de Mulheres Anfitrião Prospective <ol class="lalpha"><li> Se realizar um resgate de esgotamento oligo, injetar o seu mRNA (geralmente 5-30 pg de RNA) ~ 24-48 horas após a oligo. Os oligos terá degradadas por esta altura e não deve afetar o RNA injetado. </li><li> Na noite antes de realizar a transferência, adicionar 16 mL de solução de progesterona de trabalho (1mM em EtOH) para ovócitos em 8 mL OCM em pratos médio (concentração de progesterona final é ~ 2 mM). Incubar 10-12 horas a 18 ° C para permitir a maturação de oócitos. </li><li> Injetar 3-5 fêmeas com 1000 unidades por sapo de hCG para induzir a postura de ovos. Nossos experimentos parecem funcionar melhor se maturação de oócitos e injeção de hCG são feitas na mesma época, cerca de 12 horas antes da implantação no hospedeiro (eg, 22:00 AM -10). Deixe fêmeas em RT ou 18 ° C durante a noite. </li></ol> 4. Preparação e coloração Dye Vital de Oócitos <ol class="lalpha"><li> Na manhã da transferência, permitir ~ 45-60 &#39;para configurar e executar o procedimento. Neste ponto, oócitos maduros podem ser congelados para posterior análise da eficácia do knockdown mRNA ou a expressão da proteína. Além disso, verifique se os ovócitos não foram infectadas e que não havia uma boa taxa de maturação (&gt; 50%). Oócitos infectados não vai fertilizar. Descongelar corantes vitais (Materiais) e giram em velocidade máxima por 5 min. </li><li> Cores diferentes grupos experimentais, adicionando 80 mL do corante vital apropriado (s) para os pratos de oócitos e incubar com balanço de 15 &#39;. Durante este tempo, selecione uma fêmea hospedeira e começam a anestesia. Escolha um sapo que está lentamente a postura dos ovos normalmente ou que produz ovos abundante com espremendo leve. Ovos do hospedeiro deve ser de boa qualidade. Evite as fêmeas que estão colocando fios de ovos ou ovos esmagadas. </li><li> Transferir os ovos coloridos para um prato grande de OCM fresco, redemoinho brevemente para lavar e retirá-las antes da transferência. </li><li> Prepare uma pipeta Pasteur estéril com furo apenas larga o suficiente para acomodar um oócito (~ 1,5 mm) para uso em transplante de oócitos. Pontuação da pipeta com um lápis de diamante e quebrar limpa. Fogo polonês até que as bordas são lisas, tomando cuidado para não derreter a abertura fechada. </li></ol> 5. Realizar o transplante de oócitos <ol class="lalpha"><li> Transplante de oócitos usa os mesmos procedimentos cirúrgicos, como descrito na Parte I, embora em vez de remover ovário, óvulos manipulados são introduzidos na cavidade do corpo com uma pipeta. Idealmente, o processo de transferência deve ser realizada o mais rapidamente possível eo tamanho da incisão deve ser mantido o menor possível. </li><li> Anesthesize a fêmea hospedeira e elaboração de instrumentos cirúrgicos, como descrito na Parte I. Fazer e incisão, tal como descrito na Parte I. A incisão pode ser menor, mas precisa ser grande o suficiente para caber o furo da pipeta de transferência (Figura 2A). </li><li> Transplantar os oócitos, segure e elevar um retalho de fáscia muscular e com uma pinça e introduzir os oócitos experimental utilizando a pipeta Pasteur preparou acima. Redemoinho o prato de oócitos para coletá-los para o centro e sugar o máximo possível. Permitir que os ovócitos para resolver na extremidade da pipeta para evitar o excesso de líquido a ser introduzido e insira a ponta da pipeta na incisão e, lentamente, os oócitos permitir a gotejar para dentro da cavidade do corpo (Figura 2B). Repita até que todos os oócitos foram transferidos. Não solte a camada muscular a qualquer momento, até que começaram a sutura, ou os oócitos vai derramar da incisão. </li><li> Uma vez que os oócitos foram transferidos, segure ambos os lados da incisão com uma pinça e reuni-los, permitindo que os ovócitos para se adaptar à cavidade do corpo. Começar a sutura como descrito, tendo o cuidado de manter a tensão ascendente sobre o músculo e fáscia até o primeiro nó é amarrado (Figura 2C). Isto irá manter os oócitos de ser expulso e vai permitir que as bordas da incisão para curar uniformemente. Adicionar outro de sutura na camada muscular / fascia e sutura da pele. </li><li> Enxaguar a fêmea com água deionizada e colocá-la em um balde cheio de recuperação de resfriados (18 ° C) água Amquel-tratada. Monitorar sua recuperação da anestesia como acima. Ela deveria começar a botar ovos normalmente após a operação. </li><li> Obtenção de testículos de um sapo macho usando os procedimentos normais. Armazenar os testículos na OCM ou L15 até que seja necessário. Nós preferimos testículo fresco quando fertilização experimentos de transferência. </li></ol> 6. Fertilização de recuperação de oócitos e in vitro <ol class="lalpha"><li> Cílios peritoneal irá conduzir os ovos transferidos (e normal ovos coelomic do host) para as aberturas dos ovidutos na anterior da cavidade do corpo. Ovos coloridos podem ser recuperados início 2-3 horas após a transferência apertando normal. Os ovos podem ser obtidas a cada meia hora ou até a fêmea pára de postura. </li><li> Fertilize em uma spesuspensão rm (em ~ 4 mL 1x MMR) por 4 minutos. Flood e enxaguar bastante com 0,1 x MMR. Os ovos devem ativar normalmente e vai começar a decompor ~ 1,5-2 horas após a fertilização. Ovos transferidos, muitas vezes, unir um pouco mais tarde do que ovos do hospedeiro. </li><li> Retire as peles geléia com cisteína como embriões normais e classificar em pratos separados. Isto pode ser feito em qualquer fase, dependendo das necessidades do experimento. É normalmente mais fácil identificar as várias cores ao redor do palco de 4 células e mais difícil durante o final de estágios blástula. Cultura os ovos com uma densidade baixa (&lt;50 por prato médio) em 0,1 x MMR limpo. A partir deste ponto, os embriões podem ser tratados e manipulados normalmente. </li><li> Devolver os sapos à facilidade de animais e acompanhar de complicações ao longo dos próximos dias. </li><li> Método de fertilização suplente; postura em tampão de sal de alta <ol class="lroman"><li> Após o sapo se recuperou da anestesia, colocá-la em ~ 1L de alta-sal MMR (1.2x). Permitir que a fêmea põe ovos no buffer por cerca de 4-6 horas. Squeeze ovos restantes para fora, drenagem MMR 1.2x e classificar ovos coloridos em prato limpo, remova todo o líquido possível. </li><li> Lavar exaustivamente com MMR 0.3x e fertilizar no volume mínimo de suspensão MMR / esperma 0.3x até que os ovos activate (10 minutos). Cobrir com 0,1 x MMR e da cultura como acima. Esta opção é útil se os ovos são necessárias muitas no mesmo estágio ou se expressão manual de ovos danifica os ovócitos. </li></ol></li></ol>

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	<li>Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+maturation+in+vitro:+contribution+of+the+oviduct+to+total+maturation+in+Xenopus+laevis.">Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis.</a> Experientia. 31, 1275-1276 (1975).</li><li>Elinson, R. P., Pasceri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+UV-sensitive+targets+in+dorsoanterior+specification+of+frog+embryos.">Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos.</a> Development. 106, 511-518 (1989).</li><li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. 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Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Universidade de Iowa IACUC Comitê.

A transferência bem sucedida irá resultar na fertilização e clivagem normal de&gt; 50% dos oócitos (Figura 3). Geralmente entre 30-60% dos oócitos transferidos sobreviverá após os estágios nêurula. Nós normalmente transferência 75-150 oócitos por grupo experimental, que vai produzir embriões suficientes para vários tipos de análise (in situ, RT-PCR), bem como visualizar o fenótipo. Implantação de ovócitos substancialmente mais não parece aumentar significativamente o rendimento. Além disso, pelo me...

Soluções e receitas: OCM (meio de cultura de oócitos; modificado a partir Wylie et al, 1996). <table border="0"><tbody><tr><td> 70% L-15 Leibovitz de médio (contendo L-Glutamina) </td><td> (Invitrogen 11415-064) </td></tr><tr><td> 0,4 mg / ml de albumina bovina sérica (BSA; V fração) </td><td> (Sigma A-9418-50g) </td></tr><tr><td> 1x penicilina-estreptomicina </td><td> (Sigma P-0781) </td></tr><tr><td colspan="2"> Ajuste para 7,6-7,8 pH com NaOH 5N </td></tr><tr><td colspan="2"> Fazer nova loja, semanal a 18 ° C. </td></tr></tbody></table> MMR 10X (solução modificada de Marc Ringer;. Zuck et al, 1998) <table border="0"><tbody><tr><td> 1M NaCl </td></tr><tr><td> 20 mM KCl </td></tr><tr><td> 20 mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> HEPES 150 mM </td></tr><tr><td> ajustar o pH 7,6-7,8 </td></tr><tr><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr></tbody></table> Solução anestésica <table border="0"><tbody><tr><td> 1 g / L 3-aminobenzóico Ethyl Ester (MS222) </td><td> (Sigma A-5040) </td></tr><tr><td colspan="2"> Bicarbonato de sódio 0,7 g / L </td></tr><tr><td colspan="2"> Dissolver em água tratada Amquel- </td></tr><tr><td colspan="2"> Faça fresco semanal </td></tr></tbody></table> Stocks de progesterona <table border="0"><tbody><tr><td> Progesterona 10 mM (Sigma P-0130) em etanol 100% </td></tr><tr><td> Diluir a 1 mM em etanol 100% para um estoque 500x solução / trabalho </td></tr><tr><td> Armazenar a -20 ° C </td></tr></tbody></table> Corantes vitais (modificado de Heasman et al., 1991) <table border="0"><tbody><tr><td> Azul: 0,1% Nilo Azul A </td><td> (Aldrich 121.479-5G), </td></tr><tr><td> Vermelho: 0,25% Vermelho Neutro </td><td> (Sigma N-6634), </td></tr><tr><td> Brown: 1% Bismarck Brown </td><td> (Sigma B-2759), </td></tr><tr><td colspan="2"> Verde (80 mL + 80 azul castanho mL), </td></tr><tr><td colspan="2"> Malva (80 vermelho azul + 80 mL mL). </td></tr><tr><td colspan="2"> A cor sexta, Orange (80 mL vermelho + 80 mL marrom), também pode ser usado, mas é muitas vezes difícil de distinguir de castanho. </td></tr></tbody></table> Estoques de azul, vermelho e marrom são compostos em água deionizada em tubos de 50 ml, incubadas por 20 minutos com balanço e fiado em uma centrífuga clínica. Os sobrenadantes são aliquotado em tubos de microcentrífuga e armazenadas a -20 ° C.

fertilization of xenopus oocytes using the host transfer method

Estudar a contribuição de moléculas herdada da mãe para o desenvolvimento inicial dos vertebrados é frequentemente prejudicada pelo tempo e despesa necessária para gerar animais mutantes efeito materno. Além disso, muitas das técnicas para superexpressão ou inibir a função do gene em organismos como Xenopus e zebrafish não suficientemente alvo crítico materna vias de sinalização, tais como sinalização Wnt. Em Xenopus, manipulando a função do gene em oócitos cultivados e, posteriormente, fecundá-los pode amenizar esses problemas até certo ponto. Ovócitos são manualmente defolliculated de tecido de ovário doador, injetado ou tratados de cultura como desejado, e então estimulados com progesterona para induzir a maturação. Em seguida, os oócitos são introduzidos na cavidade do corpo de um sapo anfitrião ovulando feminino, quando então eles serão translocados através do oviduto do hospedeiro e adquirir modificações e casacos de geléia necessário para a fertilização. Os embriões resultantes podem então ser aumentado para o estágio desejado e analisadas para os efeitos de quaisquer perturbações experimental. Este método de transferência de anfitrião tem sido altamente eficaz em descobrir mecanismos básicos do desenvolvimento inicial e permite uma ampla gama de possibilidades experimentais não disponíveis em qualquer outro organismo vertebrado modelo.

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Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedimento para fertilizar<em&gt; Oócitos Xenopus</em&gt; Pelo método de transferência de host.

Fertilização de Oócitos Xenopus Utilizando o método de transferência do host

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

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Research

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Biology

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

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Vídeo: Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

Transferência nuclear em oócitos de camundongos

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Biologia

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Gravação de patch-clamp de canais iônicos Expresso em Oócitos Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Um método de alta taxa de transferência para Zebrafish criopreservação de espermatozóides e In Vitro Fertilização

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizando Localização RNA em Xenopus Oócitos

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinação tecido Usando o Transplante Cap Animal (ACT) em Ensaio Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage checkpoint signaling as a surveillance mechanism to sense DNA damage and direct cellular responses to DNA damage. There are several groups of proteins called sensors, transducers and effectors involved in DNA damage checkpoint signaling (Figure 1). In this complex signaling pathway, ATR (ATM and Rad3-related) is one of the major kinases that can respond to DNA damage and replication stress. Activated ATR can phosphorylate its downstream substrates such as Chk1 (Checkpoint kinase 1). Consequently, phosphorylated and activated Chk1 leads to many downstream effects in the DNA damage checkpoint including cell cycle arrest, transcription activation, DNA damage repair, and apoptosis or senescence (Figure 1). When DNA is damaged, failing to activate the DNA damage checkpoint results in unrepaired damage and, subsequently, genomic instability. The study of the DNA damage checkpoint will elucidate how cells maintain genomic integrity and provide a better understanding of how human diseases, such as cancer, develop.
Xenopus laevis egg extracts are emerging as a powerful cell-free extract model system in DNA damage checkpoint research. Low-speed extract (LSE) was initially described by the Masui group1. The addition of demembranated sperm chromatin to LSE results in nuclei formation where DNA is replicated in a semiconservative fashion once per cell cycle.
The ATR/Chk1-mediated checkpoint signaling pathway is triggered by DNA damage or replication stress 2. Two methods are currently used to induce the DNA damage checkpoint: DNA damaging approaches and DNA damage-mimicking structures 3. DNA damage can be induced by ultraviolet (UV) irradiation, &gamma;-irradiation, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinoline-1-oxide (4-NQO), or aphidicolin3, 4. MMS is an alkylating agent that inhibits DNA replication and activates the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint 4-7. UV irradiation also triggers the ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint 8. The DNA damage-mimicking structure AT70 is an annealed complex of two oligonucleotides poly-(dA)70 and poly-(dT)70. The AT70 system was developed in Bill Dunphy's laboratory and is widely used to induce ATR/Chk1 checkpoint signaling 9-12.
Here, we describe protocols (1) to prepare cell-free egg extracts (LSE), (2) to treat Xenopus sperm chromatin with two different DNA damaging approaches (MMS and UV), (3) to prepare the DNA damage-mimicking structure AT70, and (4) to trigger the ATR/Chk1-mediated DNA damage checkpoint in LSE with damaged sperm chromatin or a DNA damage-mimicking structure.

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Xenopus egg extract is a useful model system to investigate the DNA damage checkpoint. This protocol is for the preparation of Xenopus egg extracts and DNA damage checkpoint inducing reagents. These techniques are adaptable to a variety of DNA damaging approaches in the study of the DNA damage checkpoint signaling.

Estudo da Checkpoint Dano ao DNA usando<em&gt; Xenopus</em&gt; Os extratos de ovos

On a daily basis, cells are subjected to a variety of endogenous and environmental insults. To combat these insults, cells have evolved DNA damage ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Medindo o transporte de catiões de Na, K e H, K-ATPase em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos por espectrofotometria de absorção atômica: uma alternativa para Ensaios de Radioisótopos

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...