Agradecemos a David Theilmann (Pacific Agri-Food Research Centre, Summerland, British Columbia) para fornecer o baculovírus AcMNPV e para a discussão útil. Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Canadense para a Inovação (CFI), o Canadian Institutes of Health Research (CIHR), a Fundação Michael Smith para Pesquisa em Saúde (MSFHR), e as Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia Council of Canada (NSERC) .

Parte 1: Preparação de ovócitos para Xenopus microinjeção <ol><li> Coloque um pedaço pequeno (cerca de 2 cm) de Xenopus ovário laevis em um tubo de 50 ml cônico contendo 20 ml de colagenase solução (5 mg / ml de colagenase em cálcio livre modificado Barth salina: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO 4, 10 mM Hepes, pH 7,5). Colagenase é usado para remover as células do folículo que cercam os oócitos. </li><li> Colocar o tubo em uma plataforma shaker e rock-a gentilmente (a 100 RPM) por uma hora. Esse tempo varia com diferentes lotes de colagenase. Assim, após uma hora, dê uma pequena amostra de oócitos e examiná-las sob um microscópio de dissecação. Adequadamente de-folliculated oócitos devem ser bem separados um do outro, e isso deve ser fácil de inserir uma agulha de vidro no citoplasma do ovócito. Se os oócitos não são suficientemente de-folliculated, eles são deixados na solução de colagenase e verificados novamente a cada cinco minutos. </li><li> Lavar os oócitos três vezes com solução salina modificada Barth (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,82 mM MgSO 4, 0,33 mM Ca (NO 3) 2, 0,41 mM CaCl 2, 10 Hepes mM, pH 7,5), e transferi-los para um de 100 mm de diâmetro prato de Petri contendo MBS mais 1% de penicilina / estreptomicina. Os ovócitos são agora pronto para ser microinjeção. Se microinjeção será realizada em outro dia, armazenar os ovócitos a 4 ° C por até uma semana. </li><li> Usando um microscópio de dissecação, selecione oócitos estágio maduro VI para microinjeção. Estes oócitos são grandes, com bom contraste entre o hemisfério negros de origem animal e do hemisfério cremosa de cor vegetal. </li><li> Transferência dos ovócitos maduros VI estágio em uma microplaca (Nunc, 10 mL de volume bem). Isto deve ser feito com cuidado, usando uma pipeta de 200 mL com uma ponteira que foi cortado no final para permitir sucção ininterrupta dos ovócitos. </li></ol> Parte 2: microinjeção de oócitos Xenopus <ol><li> Prepare o substrato de importação a microinjeção, adicionando uma pequena quantidade de 1% azul de bromofenol, para ajudar na visualização de microinjeção. Por exemplo, podemos adicionar 1 ml de azul de bromofenol para 10 ml de substrato. </li><li> Coloque uma pequena tira de Parafilm em um prato de 100 mm de diâmetro Petri, e dispensar uma queda de 5 mL da solução a ser injetado na faixa Parafilm. </li><li> Preencher uma agulha de injeção previamente calibrado (obtida por puxar um 6,6 mL micropipeta Drummond com o Inject + Extrator Matic) com a solução a ser injetada. Para isso, o microinjetor está definido o modo de aspiração. Para calibrar a agulha de injeção fazer marcas ponto na agulha a cada 0,5 mm, que correspondem a um volume de 50 nl. </li><li> Para injeção citoplasmática, insira a ponta da agulha em um óvulo no hemisfério vegetal, muito perto do hemisfério animal, em um ângulo de aproximadamente 45 graus. Ativar a configuração microinjetor para microinject e microinject cada ovócito com 50 nl de substrato de importação. As marcas de ponto na agulha são usados ​​para monitorar a quantidade de substrato que foi injetado. </li><li> Transferir os oócitos injetados para uma pequena placa de Petri (35 mm de diâmetro) cheio de MBS, e incubar à temperatura ambiente durante o período de tempo desejado (pontos no tempo são escolhidos de forma a permitir a observação do substrato importação associado com NPCs, o que ocorre entre 10 e 30 minutos para as proteínas e vírus que são ativamente transportados para o NPC, desta vez também depende do local da injeção e do tamanho da proteína / vírus). </li><li> Quando a incubação é completa, a transferência de oócitos para um frasco de vidro de 4 ml contendo glutaraldeído 2% em MBS, e corrigir durante a noite a 4 ° C. </li></ol> Parte 3: Dissecção de oócitos Xenopus <ol><li> No dia seguinte, lave os oócitos 3 vezes com MBS. </li><li> Transferência de oócitos a uma placa de Petri pequena preenchida com tampão de pouco sal (LSB: 1 mM KCl, 0,5 mM MgCl 2, 10 mM HEPES, pH 7,5). Usando um microscópio de dissecação e dissecando uma pinça, remova o pólo vegetal de cada ovócito. É útil para estabilizar o ovócito sendo dissecado com um par de pinças, enquanto o outro par é usado como tesouras para remover o pólo vegetal. Neste ponto, é possível avaliar o sucesso da microinjeção pela presença de uma coloração azul no citosol. O protocolo é mantido apenas para os oócitos que receberam microinjeções com sucesso. Além disso, se as amostras devem estar preparados para EM, este passo dissecção torna muito mais fácil encontrar o núcleo quando desbastar e cortar as amostras. </li><li> Corrigir os oócitos dissecados novamente com glutaraldeído 2% em LSB durante uma hora a temperatura ambiente. </li><li> Após a fixação, lave os oócitos dissecados três vezes com LSB. </li></ol> Parte 4: Preparação de Oócitos Injected para Incorporação e Thin-Seccionamento EM <ol><li> Transferir os oócitos dissecados para um slide depressão. Aspirar o máximo de líquido como posvel, e então rapidamente (para que não sequem) abrangem os oócitos dissecados com 2% de baixo ponto de fusão agarose. Enquanto a agarose ainda está mole, use uma ponteira para separar os oócitos uns dos outros, e para garantir que cada ovócito está virada para cima ou para baixo (não para os lados). </li><li> Permitir que a agarose para solidificar por aproximadamente 10 minutos. Uma vez que a agarose se solidifica, use uma lâmina de barbear para cortar a agarose em pequenos pedaços, cada um contendo um óvulo dissecados. </li><li> Coloque os oócitos agarose-incorporado em um frasco de vidro de 4 ml, e pós-corrigi-los com 1% OsO 4 em LSB durante uma hora a temperatura ambiente. </li><li> Lavar a amostra três vezes em LSB. Se necessário, guardar a amostra a 4 ° C durante a noite e continuar o protocolo no dia seguinte. </li><li> Seqüencialmente desidratar as amostras em uma série crescente de álcool (50, 70, e etanol 90% por 20 min cada). Isso é seguido por duas mudanças em etanol 100% por 15 min cada. Finalmente desidratar as amostras com acetona 100% por 15 min. </li><li> Infiltrar amostras com uma mistura 1:1 de Epon (Fluka) e acetona por uma hora, seguido de infiltração com uma mistura 2:1 de Epon e acetona por duas horas, e finalmente em Epon puro por pelo menos seis horas. </li><li> Colocar as amostras em moldes de incorporação flat cheio de fresco e puro Epon. Os ovócitos são orientados de tal forma que o lado do núcleo mais próximo do local da injeção - neste caso o lado dos oócitos que tem sido dissecado - será seccionada em primeiro lugar. Este passo otimiza a oportunidade de visualizar de importação do substrato escolhido. </li><li> Finalmente, a Epon polimerizar por dois dias a 60 ° C. </li><li> Para visualizar as amostras, os blocos são cortados e seccionados usando um ultramicrótomo. As seções são transferidos para as redes EM, coradas utilizando o procedimento padrão, e visualizados com um microscópio eletrônico de transmissão. Não vamos mostrar essa parte do protocolo, pois é procedimento padrão EM. </li></ol> Parte 5: Resultados Representante: Se o protocolo tem sido bem sucedida, então o envelope nuclear (NE) e NPCs deve ser claramente visível em micrografias EM. Dependendo do substrato e injetada a quantidade de tempo entre a injeção e fixação, o substrato deve estar visível na face citoplasmática da NPC, no NPC, ou em face nuclear do NPC. A Figura 1 mostra um NE seção transversal com citoplasma adjacente (c) e núcleo (n) a partir de um ovócito Xenopus que foi injetado com capsídeos do baculovírus AcMNPV, incubadas a 4 ° C por quatro horas, e processadas para a incorporação e seção fina EM, como descrito. Setas apontam para NPCs. A docking capsídeo na face citoplasmática de um NPC é indicado por uma seta branca. Em contraste, a Figura 2 mostra uma seção transversal NE com citoplasma adjacente (c) e núcleo (n) a partir de um ovócito Xenopus que foi injetado com o vírus da parvovirose Minuto de Ratos (MVM), incubadas à temperatura ambiente durante quatro horas, e processadas para a incorporação e seção fina EM como descrito. Usando esta técnica, nós descobrimos que induz MVM interrupções da NE (Cohen e Pante, 2005). Parênteses indicam quebra no NE. Setas apontam para NPCs. Capsídeos MVM putativos associados à NE são indicados por setas brancas. <img src="/files/ftp_upload/1106/1106_fig1.png" alt="Figura 1" width="600" height="459" /> Figura 1: Micrografia eletrônica de uma secção transversal-NE com citoplasma adjacente (c) e núcleo (n) a partir de um ovócito Xenopus que foi injetado com capsídeos do baculovírus Ac MNPV, incubadas a 4 ° C por quatro horas, e processados ​​para incorporação e seção fina EM como descrito. Setas apontam para NPCs. Capsídeos são indicados por setas brancas. Barra de escala: 100 nm. <img src="/files/ftp_upload/1106/figure2.png" alt="Figura 2" width="600" height="264" /> Figura 2: Micrografia eletrônica de uma secção transversal-NE com citoplasma adjacente (c) e núcleo (n) a partir de um ovócito Xenopus que foi injetado com o vírus da parvovirose Minuto de Ratos (MVM), incubadas à temperatura ambiente durante quatro horas, e processadas para a incorporação e seção fina EM como descrito. Setas apontam para NPCs. Parênteses indicam quebra no NE. Capsídeos MVM putativos associados à NE são indicados por setas brancas. Barra de escala: 100 nm.

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	<li>Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+intact+Xenopus+oocytes+in+nucleocytoplasmic+transport+studies.">Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies.</a> Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).</li><li>Pant&#233;, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+pore+complex+is+able+to+transport+macromolecules+with+diameters+of+about+39+nm.">Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).</li><li>Rabe, B., Vlachou, A., Pant&#233;, N., Helenius, N., Kann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+import+of+hepatitis+B+virus+capsids+and+release+of+the+viral+genome.">Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).</li><li>Cohen, S., Pant&#233;, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+Envelope:+Microinjection+of+MVM+into+Xenopus+oocytes+causes+damage+to+the+nuclear+envelope.">Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope.</a> J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).</li><li>Pant&#233;, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+nuclear+export+of+different+classes+of+RNA+by+electron+microscopy.">Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy.</a> RNA. 3, 498-513 (1997).</li></ol>

Microinjeção de oócitos Xenopus combinado com thin-corte EM é uma ferramenta altamente eficaz para estudar o transporte nucleocytoplasmic. Este sistema tem sido usado para mapear etapas distintas de importação através do NPC, por exemplo, a interação de um substrato de importação nuclear com componentes estruturais do NPC, tais como os filamentos citoplasmáticos e cesta nuclear (revisado por Pante, 2006). Também tem sido usado para estudar a importação nuclear nuclear de replicar-vírus (Pante e ...

microinjection of xenopus laevis oocytes

Microinjeção de oócitos Xenopus laevis seguido por thin-corte de microscopia eletrônica (EM) é um excelente sistema para estudar o transporte nucleocytoplasmic. Por causa de seu grande núcleo e alta densidade dos complexos de poro nuclear (NPCs), o transporte nuclear pode ser facilmente visualizado no oócito Xenopus. Visão muito sobre os mecanismos de importação e exportação nuclear foi adquirida através do uso deste sistema (revisado por Pante, 2006). Além disso, temos utilizado microinjeção de oócitos Xenopus para dissecar as vias de importação nuclear de vários vírus que se replicam no núcleo host. Aqui demonstramos a microinjeção citoplasmática de oócitos Xenopus com um substrato importação nuclear. Mostramos também a preparação dos oócitos injetados para visualização por thin-corte EM, incluindo dissecção, desidratação e incorporação dos oócitos em uma resina epóxi incorporação. Finalmente, fornecemos resultados representativos para oócitos que foram microinjeções do capsídeo do baculovírus nucleopoliedrovirus Autographa californica (AcMNPV) ou o vírus da parvovirose Minuto de Ratos (MVM), e discutir possíveis aplicações da técnica.

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Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Aqui demonstramos microinjeção citoplasmática de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oócitos com um substrato de importação nuclear, bem como a preparação dos oócitos injetados para visualização por thin-corte de microscopia eletrônica.

Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Research

JoVE Journal

Biology

22.9K visualizações.  University of British Columbia - UBC. Aqui demonstramos microinjeção citoplasmática de Xenopus laevis Oócitos com um substrato de importação nuclear, bem como a preparação dos oócitos injetados para visualização por thin-corte de microscopia eletrônica.

Vídeo: Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Incorporação de plástico e secção de embriões Xenopus laevis

Biologia

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Obtenção de ovos de Xenopus laevis fêmeas

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Preparação e fracionamento de Xenopus laevis Egg Extractos

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Gravação de patch-clamp de canais iônicos Expresso em Oócitos Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizando Localização RNA em Xenopus Oócitos

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

Fertilização de Oócitos Xenopus Utilizando o método de transferência do host

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinação tecido Usando o Transplante Cap Animal (ACT) em Ensaio Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Produção de transgênicos Xenopus laevis Por Restrição Integração Mediada por Enzima e Transplante Nuclear

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Transplantes faciais em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Os embriões

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...