Agradecemos membros atuais e antigos do laboratório Rubenstein para proporcionar um ambiente de apoio e entusiasmo pesquisa. Agradecemos Ryan T. Gibson de assistência em otimização de protocolo. Agradecemos Mark Hochstrasser (Universidade de Yale) e Dieter Wolf (Universität Stuttgart) para cepas de leveduras e plasmídeos. Agradecemos aos nossos revisores anônimos por sua ajuda para melhorar a clareza ea utilidade deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado por um prémio de investigação a partir do capítulo Ball State University de Sigma Xi para SGW, a National Institutes of Health subvenção (R15 GM111713) para EMR, um prémio de investigação Ball State University aspirar a EMR, e fundos da Ball State University Gabinete do Reitor e do Departamento de Biologia.

1. Yeast Crescimento ensaio para identificar mutantes candidatos defeituosos na degradação de proteínas <ol><li> Transformação de tipo selvagem e mutantes de células de levedura com um plasmídeo que codifica uma proteína instável fundida, na estrutura, para um repórter enzima metabólica. </li><li> Inocular os transformantes em 5 ml de sintético definido (SD) meio mínimo que é selectivo para células contendo moléculas de plasmídeo. Incubar durante a noite a 30 ° C, rotação. </li><li> Medir a densidade óptica a 600 nm (OD600) de cada cultura durante a noite. NOTA: A seguir à incubação durante a noite, as células em cultura podem ser, em cada fase de crescimento logarítmica ou estacionária, mas deverá ter atingido um mínimo OD 600 de 0,2. De crescimento lento muito estirpes de levedura pode exigir tempos de incubação mais longo do que uma noite, ou a inoculação de um maior número de células, como determinado empiricamente. </li><li> Prepare seis diluições em série de células de levedura transformadas num estéril placa de 96 poços, começando com células diluídas para uman DO600 de 0,2. Colocar cada transformante de levedura a ser doseada numa linha diferente na placa de 96 poços. <ol><li> Para cada transformante, calcular o volume de cultura durante a noite necessária para diluir as células até uma OD 600 de 0,2 num volume final de 200 ul. Adicionar este volume de cultura de uma noite para o correspondente poço na coluna 1. Adicionar a quantidade apropriada de água estéril para levar o volume até 200 ul. </li><li> Para cada linha de levedura, adicionar 125 uL de água estéril para os poços nas colunas 2, 3 e 4. NOTA: placas de 96 poços estéreis embalados individualmente podem ser embalados com tampas estéreis. As tampas podem ser utilizadas como reservatórios para a água estéril que é distribuído neste passo. Isto permite a transferência simultânea de água estéril para todos os poços de uma dada coluna com uma pipeta multicanal. </li><li> Misturar os conteúdos da primeira coluna (levedura diluída até uma DO 600 de 0,2), pipetando para cima e para baixo com uma pipeta multicanal. </li><li> Transfer 25 ul de levedura a partir da coluna 1 para a coluna 2, utilizando um pipetador multicanal. Misturar por pipetagem cima e para baixo. Transferir 25 ul da coluna 2 para a coluna 3, e 25 ul da coluna 3 a Coluna 4 (misturando bem a cada passo). </li></ol></li><li> Misturar cada amostra com uma pipeta multicanal. Partindo mais diluído para menos diluir colunas de levedura, pipeta 4 ul de cada amostra em duas placas contendo o meio selectivo apropriado. Use uma placa com meio que mantém seleção plasmídeo (esta placa serve como uma mancha de levedura e controle do crescimento). Usar uma segunda placa com meio que selecciona para manutenção do plasmídeo e a expressão da proteína instável fundido com a enzima repórter. Porque levedura resolver rapidamente, misture células por pipetagem cima e para baixo em intervalos regulares. NOTA: Secador de placas será mais facilmente absorver o líquido que as placas preparadas na hora e são, portanto, recomendado para estas experiências. Placas húmidas podem ser secas por incubação a temperatura ambiente em low humidade para 1 - 2 dias ou mais curtos, em incubações uma câmara de fluxo laminar. As placas podem secar desigualmente se o fluxo de ar laminar é paralelo à mesa. A utilização de um molde torna mais fácil de detectar células de levedura, a distâncias regulares. Dois modelos de amostra são fornecidos na Figura 1. Estes podem ser impressa, cortada, e afixada no interior de uma tampa de placa de Petri. </li><li> Permitir que as placas para secar em cima da bancada. </li><li> Incubar as placas a 30 ° C durante 2 - 6 dias. </li><li> Fotografar cada placa após a incubação. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52428/52428fig1large.jpg" width="650" /> Figura 1. Modelos para detectar células em placas de agar de levedura de 100 mm. Estes modelos podem ser utilizados para facilitar a mancha de levedura a distâncias regulares com um pipetador multicanal. Modelos pode ser impressa, cortada, e afixada no interior de uma tampa de placa de Petri. Coloque placa de Petri com o crescimentotampa interna médio com template aposta. Os modelos são marcados com um entalhe para acompanhar a orientação. Recomenda-se que as placas utilizadas em ensaios de crescimento ser marcado de forma semelhante com um entalhe para controlar a orientação. Modelos para manchar quatro (A) ou cinco (B) diluições em série de células de levedura são fornecidos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52428/150126 Fig 1.pdf" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão para impressão desta figura com modelos de 100 mm.</a> 2. A confirmação bioquímica do ensaio de crescimento do fermento <ol><li> O crescimento de células de levedura e Pós-Extração alcalina Protein (modificado a partir de 31) <ol><li> Transformação de tipo selvagem e mutantes de células de levedura com um plasmídeo que codifica a proteína instável. </li><li> Inocular os transformantes em 5 ml de meio SD que é selectivo para células contendo moléculas de plasmídeo. Incubar durante a noite a 30 ° C, rotação. </li><li> Medir a OD 600 de cada dia para o outro cuLTURE. NOTA: A seguir à incubação durante a noite, as células podem estar em qualquer fase de crescimento logarítmica ou estacionária, mas deverá ter atingido uma densidade óptica 600 que vai permitir a diluição para uma OD600 de 0,2 em 10 ml de meio selectivo fresco (passo 2.1.4). De crescimento lento muito estirpes de levedura pode exigir tempos de incubação mais longo do que uma noite, ou a inoculação de um maior número de células, como determinado empiricamente. </li><li> Dilui-se células de levedura para uma DO 600 de 0,2 em 10 ml de meio selectivo fresco. </li><li> Continue-se a incubar as células a 30 ° C, rotação ou agitação, até que as culturas atingem uma DO 600 compreendida entre 0,8 e 1,2 (ou seja, são em meados de crescimento logarítmica). NOTA: Se a proteína de interesse é instável sob o controlo de um promotor regulável, o tempo óptimo de indução da expressão da proteína e a colheita de células pode variar de acordo com estudos anteriores ou observações empíricas. </li><li> Recolha 2,5 OD 600 unidades de cultura em 15 ml cônicaai tubo por centrifugação a 5000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração. NOTA: Uma unidade DO600 é definida como a quantidade de levedura presente em 1 ml de cultura a OD 600 de 1,0. O volume de cultura (em ml) necessária para a colheita de 2,5 OD 600 unidades (V) pode ser determinada usando a seguinte equação: V = 2,5 unidades de OD 600 / OD 600 Medido </li><li> Ressuspender as células em 1 ml de água destilada. Transferir as células em suspensão para um tubo de microcentrífuga. </li><li> Peletizar as células por centrifugação a 6500 xg durante 30 segundos a temperatura ambiente. Remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração. </li><li> Ressuspender as células em 100 ml de água destilada por pipetagem cima e para baixo ou vórtex, e adicionar 100 mL de NaOH 0,2 M. Misturar por pipetagem cima e para baixo. Incubar as amostras durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Células de pellets (a maioria dos quais ainda não divulgados proteínas e ainda são viáveis) por centrifugação a 18.000 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante por pipetagem ou aspiração. </li><li> Pelete Ressuspender em 50 - 100 ul de tampão de amostra de Laemmli 1x, que irá lisar as células, pipetando para cima e para baixo ou vórtex. NOTA: A remoção do sobrenadante após a centrifugação alcalina e subsequente ressuspensão das células em tampão de amostra de Laemmli extrai proteínas a um pH compatível com dodecil sulfato de sódio a electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), utilizando um sistema tampão de corrida Tris-glicina e western blotting. </li><li> Para desnaturar proteínas totalmente, lisados ​​incubar a 95 ° C durante 5 min. NOTA: As proteínas de agregação propensas (por exemplo, proteínas com vários segmentos transmembranares) pode tornar-se insolúvel quando incubadas a 95 ° C. Portanto, os lisados ​​devem ser incubados a temperaturas mais baixas (por exemplo, 37 ° C - 70 ° C) durante 10 - 30 min, como determinado empiricamente, para a análise de tais proteínas. </li><li> Super lisados, colocando em gelo por 5 min. </li><li> Centrifugar os lisados ​​a 18000 xg durante 1 min à temperatura ambiente para precipitar o material insolúvel. Separa-se o sobrenadante (proteína extraída solubilizado) por SDS-PAGE antes da subsequente análise de Western blot (secção 2.2). Alternativamente, armazenar lisados ​​a -20 ° C. </li></ol></li><li> Protocolo de Western Blotting representativas <ol><li> Carregar o volume determinado empiricamente de lisados ​​em um gel de SDS-PAGE. </li><li> Executar gel a 200 V até a frente do corante atingir o fundo do gel. </li><li> Transferir proteínas a partir de gel de fluoreto de polivinilideno (PVDF) da membrana por transferência húmida a 20 V durante 60 - 90 min a 4 ° C. </li><li> Bloco de membrana por incubação em 5% de leite desnatado em Tris-salino tamponado (TBS), balanço, durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Decantar solução de bloqueio. </li><li> Incubar membrana com anticorpo primário específico para a proteína de interesse (ou seu epitopo tag) em 1% de leite desnatado em TBS com 0,1% de Tween-20 (TBS / T) durante 1 hora a sala de temperatura, balançando. </li><li> Decantar solução anticorpo, e lavar membrana 3 x 5 min com TBS / T, à temperatura ambiente, de balanço. </li><li> Incubar membrana com anticorpo secundário conjugado com fluoróforo adequado em 1% de leite desnatado em TBS / T durante 1 hora à temperatura ambiente, de balanço. Observação: Como fluorophores são sensíveis à luz, diluições de anticorpos fluoróforos deve ser preparado no escuro. Além disso, a incubação de membranas na presença de anticorpos fluoróforos, deve ocorrer em recipientes opacos. Isto pode ser realizado por envolvimento tabuleiros de incubação em folha de alumínio. </li><li> Decantar solução anticorpo, e lavar membrana 3 x 5 min com TBS / T, à temperatura ambiente, de balanço. </li><li> Adquirir imagem da membrana usando Li-Cor Odyssey CLx e software Imagem Studio (ou equipamentos de imagem comparável e software), de acordo com as recomendações do fabricante. </li><li> Depois de imagiologia membrana, incubar a membrana com um anticorpo primário específico de uma cargação com proteína de controlo em 1% de leite desnatado em TBS / T durante 1 hora à temperatura ambiente, de balanço. </li><li> Decantar solução anticorpo, e lavar membrana 3 x 5 min com TBS / T, à temperatura ambiente, de balanço. </li><li> Incubar membrana com anticorpo secundário conjugado com fluoróforo adequado em 1% de leite desnatado em TBS / T durante 1 hora à temperatura ambiente, de balanço. </li><li> Decantar solução anticorpo, e lavar membrana 3 x 5 min com TBS / T, à temperatura ambiente, de balanço. </li><li> Adquirir imagem da membrana usando Li-Cor Odyssey CLx e software Imagem Studio (ou equipamentos de imagem comparável e software), de acordo com as recomendações do fabricante. </li></ol></li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A metodologia aqui apresentada permite a determinação rápida e confirmação bioquímica dos requisitos genéticos para a degradação de proteínas em células de levedura. Este estudo destacou a utilidade e poder de levedura como um organismo modelo eucariótica (vários excelentes comentários da biologia fermento e compilações de protocolos para manuseio, armazenamento e manipulação de células de levedura (por exemplo, 41-44) estão disponíveis para os investigadores novos para o organis...

Degradação selectiva de proteínas é essencial para a vida eucariótica, e a degradação da proteína alterada contribui para um certo número de condições médicas, incluindo vários tipos de cancro, doença neurodegenerativa, doença cardiovascular, e fibrose cística 1-5. O sistema ubiquitina-proteassoma (UPS), que catalisa a degradação da proteína seletivo, é um alvo terapêutico emergente para estas condições 6-10. Ubiquitina ligases covalentemente anexar polímeros da ubiquitina ácido 76-amino de proteínas 11. Proteínas que foram marcados com correntes poliubiquitina são reconhecidos e proteolizada pelos 2,5 megadalton ~ proteassoma 26S 12. Estudos iniciados no organismo eucariota modelo Saccharomyces cerevisiae (levedura de brotamento) ter sido fundamental na elucidação dos mecanismos de degradação de proteínas em células eucarióticas. O primeiro substrato fisiológico demonstrou da UPS foi a levedura repressor da transcrição MATα2 13, 14, e muitos componentes altamente conservadas da UPS foram inicialmente identificados ou caracterizado por leveduras (por exemplo, 15-26). Descobertas feitas neste organismo modelo versátil e geneticamente tratável são susceptíveis de continuar a fornecer importantes insights sobre os mecanismos conservadas de degradação mediada por ubiquitina. Reconhecimento e degradação da maioria dos substratos UPS exigem uma acção combinada de várias proteínas. Por conseguinte, um objectivo importante na caracterização da degradação regulada de uma dada proteína é instável a determinar os requisitos genéticos para a proteólise. As abordagens clássicas (por exemplo pulse-chase e experiências cicloheximida-chase 27) para monitorar a degradação de proteínas em células de mamífero ou de levedura são trabalhosos e demorados. Embora estes tipos de metodologia proporcionar meios muito sensíveis para a detecção da degradação de proteínas, eles não são adequados para a análise rápida de degradação da proteína ou screeni grande escalang para as mutações que impedem a degradação da proteína. Aqui, um ensaio à base de levedura de crescimento para a rápida identificação dos requisitos genéticos para a degradação de proteínas instáveis ​​é apresentado. No método baseado no crescimento da levedura para analisar a degradação de proteínas, uma proteína instável de interesse (ou sinal de degradação) é fundida, na estrutura, para uma proteína que é necessária para o crescimento de levedura em circunstâncias específicas. O resultado é um substrato artificial, que pode servir como uma ferramenta poderosa para determinar os requisitos genéticos de degradação de proteínas da proteína instável de interesse. Convenientemente, as estirpes de levedura laboratorial mais comummente utilizados abrigar um painel de mutações em genes que codificam enzimas metabólicas envolvidas na biossíntese de aminoácidos específicos ou bases azotadas (por exemplo, 20,28-30). Estes enzimas são essenciais para a proliferação celular na ausência de metabolitos fornecidos exogenamente em cuja síntese das enzimas participar. Talenzimas metabólicas podem assim funcionar como repórteres à base de crescimento para a degradação de proteínas instáveis ​​ao qual se encontram fundidos. Os requisitos genéticos para a degradação da proteína pode ser facilmente elucidadas, uma vez que as mutações que impedem a proteólise irá permitir que as células portadoras do repórter degradação de crescer em condições selectivas. Uma vantagem de crescimento é uma indicação indirecta que uma mutação em particular aumenta a abundância da proteína de interesse. No entanto, a análise bioquímica direta é necessário para confirmar que uma mutação permite o crescimento através do aumento dos níveis de proteína e não através de causas indiretas ou artificial. O efeito de uma mutação na abundância da proteína pode ser confirmada por análise de mancha de Western dos níveis de proteína em estado estacionário em células que fazem e não abrigam a mutação em particular. Um método para a extracção rápida e eficiente de proteínas de levedura (incubação sequencial de células de levedura com hidróxido de sódio e tampão de amostra) numa forma adequadapara análise por transferência Western também é apresentada 31. Em conjunto, estas experiências facilitar a rápida identificação de candidatos reguladores de degradação da proteína.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator&#39;s laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator&#39;s laboratory.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1H-1,2,4-triazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC264571000</td>
			<td>Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088726001</td>
			<td>May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1X Laemmli sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable borosilicate glass tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-32</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>51028068</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>M1053-0450</td>
			<td>Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>M1053-4004</td>
			<td>For use with tube roller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581.001</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &#956;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F14403</td>
			<td>Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Neo P8x20N, 2-20 &#956;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F14401</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate imaging system (e.g. 
			Gel Doc XR+ System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8195</td>
			<td>A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 000.216&#160;</td>
			<td>Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 mL microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F-35-6-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.205</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364120</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Dri-Bath Heater</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1172011AQ</td>
			<td>Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>9140-01</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>459250</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21065</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth-based determination and biochemical confirmation of genetic requirements for protein degradation in saccharomyces cerevisiae

Degradação de proteínas Regulado é crucial para praticamente todas as funções celulares. Muito do que se sabe sobre os mecanismos moleculares e requisitos genéticos para a degradação da proteína eucariótica foi inicialmente estabelecida em Saccharomyces cerevisiae. Análises clássicas de degradação de proteínas têm contado com metodologias de pulso-Chase e cycloheximide-perseguição bioquímicos. Embora essas técnicas de fornecer os meios sensíveis para a observação de degradação de proteínas, eles são trabalhoso, demorado, e de baixo rendimento. Estas abordagens não são passíveis de triagem rápida ou em larga escala de mutações que impedem a degradação da proteína. Aqui, um ensaio baseado no crescimento das leveduras para a identificação fácil dos requisitos genéticos para a degradação da proteína é descrito. Neste ensaio, uma enzima repórter necessária para o crescimento sob condições selectivas específicas é fundida com uma proteína instável. As células a que falta a enzima repórter endógeno mas expressam a proteína de fusão pode crescer sob selecondições CTIVE apenas quando a proteína de fusão é estabilizado (ou seja, quando a degradação da proteína é comprometida). No ensaio de crescimento descrito aqui, diluições em série de tipo selvagem e mutantes de células de levedura contendo um plasmídeo que codifica uma proteína de fusão são manchados para o meio selectivo e não selectivo. O crescimento em condições selectivas é consistente com insuficiência degradação por uma dada mutação. O aumento da abundância de proteína deve ser confirmada bioquimicamente. Um método rápido para a extracção de proteínas de levedura numa forma adequada para a electroforese e Western blotting é também demonstrada. Uma leitura à base de crescimento para a estabilidade da proteína, combinado com um protocolo simples para a extracção de proteínas para análise bioquímica, facilita a rápida identificação dos requisitos genéticos para a degradação da proteína. Estas técnicas podem ser adaptadas para controlar a degradação de uma variedade de proteínas de vida curta. No exemplo apresentado, a enzima His3, o qual é necessário para a biossíntese de histidina, foi fundidapara Deg1 -Sec62. Deg1 -Sec62 é alvo de degradação após a aberrante engata a translocon retículo endoplasmático. As células que albergam Deg1 -Sec62-His3 foram capazes de crescer em condições selectivas quando a proteína foi estabilizado.

Para ilustrar esta metodologia, a enzima His3 foi fundido com o terminal carboxilo do modelo de retículo endoplasmático (ER) -associated degradação (ERAD) substrato, Deg1 -Sec62 (Figura 2A) para criar Deg1 -Sec62-His3 (Figura 3) . Deg1 -Sec62 representa um membro fundador de uma nova classe de substratos ERAD que são direcionados seguinte associação persistente, aberrante com a translocon, o canal principal responsável por proteínas em movimento atrav...

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Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Determinação baseado no crescimento e confirmação bioquímica de Requisitos Genéticos para a degradação de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

growth-based-determination-biochemical-confirmation-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

9.6K visualizações.  Ball State University. This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissecção da Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Biologia

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics quantitativa em ácidos graxos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Expressão e purificação do Fibrose Cística proteína transmembranar regulador da condutância na Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Bioquímica e Alto Rendimento Avaliação microscópica de massa gorda em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Ensaios para Monitoramento juntamente redobramento de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Purificação da fibrose cística condutância transmembrana Regulador proteína expressa em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.