Name: Vídeo: Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth
Uploaded: 2010-05-20T17:00:00
Description: 12.7K visualizações. University of California. Vídeo bioinformática é o tratamento automatizado, análise, compreensão e de mineração de dados biológicos de espaço-temporal de dados extraídos de vídeos microscópica. O objetivo deste artigo é demonstrar um método para medir-tronco embrionárias humanas crescimento da colônia de células usando um método de vídeo bioinformática.

O desenvolvimento deste método foi possível graças ao financiamento do Programa de Pesquisa relacionadas com o tabaco California Doenças, o Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia, e NSF IGERT conceder, no vídeo de Bioinformática (# 0903667) da UCR ( <a href="http://www.cris.ucr.edu/IGERT/index.php">http://www.cris.ucr .edu / IGERT / index.php</a> ). Sabrina Lin é apoiado por uma bolsa de Dissertação da Divisão de Pós-Graduação, Shawn Forteno é apoiado por uma bolsa MARC NIH, e Shruthi Satish é apoiado por uma Bolsa de Pós-Graduação Divisão. Somos gratos a Anna Trtchounian por sua ajuda na preparação das figuras. Agradecemos também a Sam Alworth e Ned Jastromb por nos ensinar como usar o software CL-Quant.

Parte 1: Procedimento Experimental Dados de vídeo contêm uma abundância de informações. No entanto, esta informação é muitas vezes difícil de extrair e quando feita manualmente por seres humanos e pode requerer muitas horas de tempo pessoal para ser concluído. Análise manual por seres humanos também está sujeito a variação de interpretação e de erro. Vídeo bioinformática envolve o uso de software de computador para o meu dados específicos a partir de imagens de vídeo. Este método de análise é rápida e pode eliminar o erro que ocorre quando a análise é feita manualmente por seres humanos. O objetivo deste artigo é demonstrar um método para quantificar-tronco embrionárias humanas crescimento da colônia célula usando um método de vídeo bioinformática. Neste trabalho, as imagens de vídeo em tempo lapso foram coletados usando um Nikon BioStation unidade de incubação CT que permite que vários campos de células a ser trabalhada ao longo do tempo (Fig. 1). Os métodos descritos neste relatório são aplicáveis ​​a dados de vídeo recolhidas por qualquer vídeo microscópicos configurar. Em nosso projeto experimental, banhado a H9 CTEh em 12 placas de cultura de tecidos bem por 48 horas. Durante este intervalo, as colônias foram autorizados a prender totalmente e espalhar sobre Matrigel. Então, as placas com colônias CTEh anexado foram transferidos para o CT BioStation e incubados por um período adicional de 48 horas. Enquanto no BioStation, imagens das colônias foram coletadas em intervalos de 7 minutos e depois foram usados ​​para criar seqüências de lapso de tempo de vídeo. Vídeos para cada colônia foram então analisados ​​para quantificar o crescimento de colônias com receitas de vídeo bioinformática desenvolvido com o software CL-Quant. As análises realizadas com receitas criadas com o software CL-Quant foram verificados quanto à veracidade manualmente usando o Adobe Photoshop. Parte 2: Preparação de colônias CTEh anexado <ol><li> CTEh crescer em Matrigel revestido 6-bem pratos, e uma vez confluência de 70% for atingido, Refaça um poço da placa de seis poços em cinco poços de uma placa de 12 poços Matrigel revestido como se segue. </li><li> Aspirar meio de um CTEh bem que o contém. </li><li> Enxágüe bem 2x com 1ml de PBS. </li><li> Adicionar 1 ml de Accutase e incubar por 1 minuto a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Adicionar 12/10 contas de vidro dentro do poço e agitar suavemente até a placa de colônias totalmente destacar do fundo do poço. </li><li> Neutralize Accutase utilizando 1ml de mTeSR médio ou médio MEF condicionado. </li><li> Centrifugar a suspensão de células em um tubo cônico de 15ml 200g por 3 minutos. </li><li> Decantar o sobrenadante eo pellet romper com 500μl de meio de mTeSR fresco. </li><li> 100μl placa queda sábios da suspensão CTEh em cada poço de uma placa de 12 poços. </li><li> Placa de rock e para trás suavemente e observar as culturas sob um microscópio de luz. Certifique-se que aglomerados de células são distribuídas uniformemente pela placa. </li><li> Coloque a placa traseira de 12 bem na incubadora. </li><li> Permitir CTEh para anexar e crescer por 48 horas (um tempo mais curto pode ser usado). </li><li> Após 48 horas, poços decantar a médio e lave com 500ul de PBS para remover as células solto. </li><li> Adicionar 1ml de meio de mTeSR a cada poço. </li><li> Comentário: Imediatamente coloque o prato na incubadora / microscópio para imagens de vídeo. </li><li> Iniciar a coleta de lapso de tempo imagens. Tente selecionar campos com discreta colônias único que não são susceptíveis de crescer em outras colônias. </li><li> Outros métodos de cultivo e criação CTEh pode ser usado no lugar do protocolo acima. </li></ol> Parte 3: Vídeo Bioinformática CL-Quant software foi usado para criar três &quot;receitas&quot; que, quando executado em seqüência, determinar o número de pixels ou área em microns para cada colônia ao longo do tempo. As três receitas são construídas em seqüência e para esta aplicação incluem segmentação, aprimoramento e medição. Analisando o crescimento CTEh colônia usando o software CL-Quant / desenvolvimento receita: <ol><li> A receita de segmentação é criado em primeiro lugar. </li><li> Digitalizar o vídeo inteiro para se certificar de que o vídeo é utilizável. Certifique-se de toda a colônia permanece no campo de visão e que outras colônias não entrar no campo. </li><li> Abrir o assistente de segmentação e clique no botão &quot;avançar&quot;. </li><li> Selecionar o canal de imagem correta (ie, fase, verde, vermelho, etc) e clique no botão &quot;avançar&quot;. </li><li> Escolha &quot;matching soft&quot; para fora das 3 opções e clique em &quot;next&quot;. </li><li> Selecione &quot;querem&quot; regiões circundando regiões na imagem tipicamente da borda exterior da colônia para a área central da colônia. <ul><li> Esta área deve ser o menor possível, mas deve ser representativa de toda a colônia. </li><li> Quando se utiliza a microscopia de contraste de fase, não se esqueça de incluir o halo ao redor da colônia para a seleção colônia precisa pelo software. </li><li> Escolha uma ou duas regiões de interesse que podem apresentar diferentespadrões de pixels dentro da colônia, mas não escolher muitos &quot;quer&quot; que pode resultar na aplicação de máscara imprecisas. </li></ul></li><li> Clique no botão &quot;avançar&quot;. </li><li> Selecione &quot;não querem&quot; regiões circundando regiões na imagem que não fazem parte da colônia e não faz parte do fundo. Estas são regiões que têm padrões que você deseja suprimir e incluir pixels de artefatos, tais como detritos e células mortas. Clique em &quot;next&quot;. </li><li> Selecione &quot;background&quot; circulando por regiões que você deseja suprimir. <ul><li> O &quot;não quero&quot; e &quot;background&quot; regiões diferem em que fundo deve ser uniforme e, provavelmente, para mostrar-se em cada quadro. </li><li> Normalmente nós selecionar o fundo cinza em torno da colônia. </li></ul></li><li> Clique no botão &quot;avançar&quot;. </li><li> Uma máscara colorida deve ser exibida ao longo da sua região de interesse (Fig 2A). </li><li> Se a máscara não precisa cobrir a região de interesse, a faixa de limiar de segmentação (localizado no canto inferior direito da tela do software) pode ser aumentada ou diminuída. </li><li> O assistente de segmentação prompts para o ajuste mais fino máscara de área, se necessário. </li><li> Se você deseja alterar a sua máscara, selecione &quot;update macio regiões matching&quot;. Isso permite que você mude o &quot;quero&quot;, &quot;não quero&quot;, ou &quot;background&quot; áreas. </li><li> Se a máscara é satisfatória, selecione &quot;aplicar limiar e salvar a minha máscara&quot;, e clique no botão &quot;avançar&quot;. </li><li> A máscara será exibida em uma cor diferente. </li><li> Selecione &quot;Concluir&quot;. </li><li> A receita deve ser exibido no canto direito superior do software, e deve ser chamado de &quot;receita de segmentação&quot;. </li><li> Renomear a receita, se quiser com um clique direito e &quot;renomear&quot;. </li><li> Para a verificação in loco, com o botão direito e coloque o mouse sobre &quot;aplicar receita&quot;. </li><li> Um menu irá mostrar que permite que você selecione o número de quadros que você deseja usar quando no local verificando a receita. Executar a receita para todos os 10 quadros de detectar verificar a precisão da colocação da máscara. </li><li> Se a máscara pega peças de pequenas regiões indesejadas ou detritos, você pode criar uma &quot;receita de melhoria&quot; para melhorar a montagem da máscara para a região de interesse. </li><li> Para criar uma receita de melhoria, clique direito no &quot;aprimoramento receita&quot; pasta e clique em &quot;novo&quot;. Uma receita nova melhoria deve ser exibido. </li><li> Do campo original de visão (FOV), clique no &quot;aprimoramento alterna módulo&quot; botão localizado à direita da imagem. Mouse sobre os ícones na barra de ferramentas para identificar a correta. </li><li> Selecione &quot;rotulagem&quot; menu dropdown. </li><li> Selecione &quot;4 rotulagem conectado&quot;. </li><li> Selecione &quot;rotulagem 4 connected2&quot;. </li><li> A nova barra de tarefas deve ser exibido. </li><li> Agarre máscara inicial (mask0) da receita de segmentação e arrastá-lo para o &quot;input&quot; caixa. </li><li> A barra deve agora mostrar &quot;máscara de entrada #&quot;. </li><li> Arraste o ícone com a &quot;máscara de entrada #&quot; para o ícone de máscara 0. </li><li> Encontrar &quot;tamanho min&quot; na barra de tarefas e ajustar o número até única região de interesse é exibida. Certifique-se de clicar em &quot;executar&quot; através de cada um julgamento apropriado. </li><li> Quando estiver satisfeito com o seu ajuste de tamanho mínimo, clique sobre a &quot;receita de melhoria&quot; que você criou anteriormente. (Fig. 2B) </li><li> Na parte inferior da tela, selecione &quot;salvar a receita&quot;. </li><li> O software agora pede para &quot;substituir receita selecionada?&quot;, Selecione &quot;sim&quot; </li><li> Verificação in loco a receita aprimoramento utilizando os mesmos procedimentos acima para verificar a segmentação local. </li><li> Se estiver satisfeito com a segmentação e receitas acessório, selecione &quot;criar modelo de medição&quot; na barra de ferramentas do lado direito. </li><li> Mudar o nome do modelo para, se desejar. </li><li> Na janela de modelo de medição, mover o cursor sobre a figura clipart celular. Segure a tecla Ctrl e selecione a célula. </li><li> Desmarque a opção &#39;default parâmetro &quot;e&quot; parâmetro área&#39; de seleção em &quot;morfologia&quot;. </li><li> Exit &#39;modelo&#39; janela. </li><li> Selecione o ícone criado na receita de medição. </li><li> Renomear a receita. </li><li> Mover e selecione &#39;modelo&#39; guia no canto superior direito. </li><li> Arrastar e soltar o seu modelo de medição criados anteriormente para a janela de medição. </li><li> Clique em &#39;Sim&#39; para continuar. </li><li> Na janela de receita de medição, selecione &#39;Canal mapeamentos&#39;, &#39;Whole célula&#39; então. </li><li> Selecione &#39;Máscara mapeamentos. </li><li> Então a opção &quot;célula Whole &#39;select para a máscara reforçada. </li><li> Selecione a &quot;receita de Medição &#39;, na guia Receita na janela principal. </li><li> Selecione a opção &#39;Save&#39; ícone dentro da janela de receita de medição. </li><li> Em seguida, feche a janela. </li><li> Agora, fechar e reabrir o &quot;FOV. </li><li> Clique direito a &#39;receita&#39; ícone &#39;lista da receita Lock&#39; selecionar e executar as receitas seqüencialmente em dados de vídeo. </li></ol> Parte 4: Verificação de precisão receita utilizando o software Photoshop A fim de validar a receita criada com (CL-Quant softwsão), os mesmos dados podem ser analisados ​​manualmente com o Adobe Photoshop. Para esta análise, cada frame 10 (a cada 70 min ponto de tempo) foi analisado para medir o tamanho colônia mais de 48 horas. <ol><li> Abrir um quadro de uma imagem de colônia em Adobe Photoshop. </li><li> Clique na ferramenta Magic Wand na barra de ferramentas. </li><li> Clique sobre a área ao redor da colônia para o campo inteiro é coberto, exceto a região da colônia. </li><li> Clique em &quot;Editar no Modo Máscara Rápida&quot; na barra de ferramentas e clique na colônia para a colônia é selecionado. </li><li> Certifique-se que a linha pontilhada ao redor da colônia se encaixa direito em torno da periferia da colônia, e não dentro dela. Se a linha pontilhada não é em torno da periferia, altere o valor de tolerância na barra de ferramentas superior em conformidade. </li><li> Vá para a &#39;Janela&#39; no menu suspenso e clique em &quot;Histograma&quot;. </li><li> Anote o valor de pixel quando cache = 1. Se o cache é de 2, clique no botão &#39;!&#39; para mudar para cache 1 e anote o valor de pixel. </li><li> Repita o processo acima para cada frame 10. Menos frames total pode ser usado, se desejar. </li><li> Dados coletados usando o Photoshop e CL-Quant software pode então ser plotados juntos. Se as receitas CL-Quant são verdadeiras, as curvas para a análise Photoshop e CL-Quant deve ser muito similar (Figs. 3-5). </li><li> Se as receitas desenvolvidas com CL-Quant são verdadeiras, eles podem ser seguramente aplicada a dados de vídeo. </li><li> O valor em uso de vídeo bioinformática nesta análise é que uma vez que a segmentação, realce, e receitas de medição são desenvolvidos e validados, eles vão realizar a análise muito mais rapidamente e com mais precisão do que um ser humano usando o Photoshop. </li></ol> Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: strip Film de uma colônia CTEh mostrando quadros em vários momentos durante 48 horas de crescimento em um CT BioStation. Quadros foram levados a 7 minutos. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: (A) Imagem de um CTEh com uma máscara colocada sobre a colônia pela receita de segmentação. Áreas de detritos e de fundo também são mascarados, indicando que uma receita de melhoria é necessária para melhorar a precisão da avaliação. (B) Imagem da mesma colônia, como mostrado em &quot;A&quot; depois de aprimoramento foi realizado. A máscara agora seleciona apenas a colônia e do ruído foi eliminado da seleção. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: Gráfico mostrando aumento no tamanho da colônia (em pixels) mais de 48 horas, conforme determinado utilizando CL-Quant software e Photoshop. Este gráfico plota os dados brutos e mostra que as colônias começam em tamanhos diferentes. Também mostra que ambos os métodos de medição estão em bom acordo. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: Gráfico mostrando os mesmos dados como na Figura 3 após a normalização para mostrar o aumento percentual no tamanho da colônia mais de 48 horas. Isso mostra que as taxas de crescimento são semelhantes, independentemente do tamanho das colônias de partida e que ambas as medidas de análise dão resultados semelhantes. <img src="/files/ftp_upload/1933/1933fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5: Gráfico mostrando os meios para os dados normalizados na Figura 4. Este gráfico mostra claramente uma boa concordância entre a análise realizada com o vídeo de bioinformática (CL-Quant software) e Photoshop e estabelece que a receita é verdadeira. O ligeiro abrandamento da área para os dados de Photoshop no quadro 325 é devido a vários vídeos não ser incluído na análise Photoshop.

Ferramentas de bioinformática de vídeo são poderosos para a rápida extração de dados de imagens de vídeo. Nosso protocolo para quantificar o crescimento de colônias CTEh demonstra uma aplicação de vídeo de bioinformática para um problema biológico. Este método é quantitativo e tem a característica interessante de dados que revelem a partir de colônias CTEh individual. Receitas de vídeo bioinformática pode ser desenvolvido para monitorar outros processos celulares como a proliferação, migração, apo...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>mTeSR1 Human Embryonic Stem Cell Maintenance Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stem Cell Technologies</td>
<td>05850</td>
<td>or any suitable medium for hESC culture.</td>
</tr>
<tr>
<td>BD Matrigel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>356234</td>
<td>or other suitable substrate.</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12 Basal Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-032</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Accutase Enzyme Cell Detachment Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>eBioscience</td>
<td>00-4555-56</td>
<td>or other suitable detachment enzyme.</td>
</tr>
<tr>
<td>3mm Glass beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>11-312A</td>
<td>optional.</td>
</tr>
<tr>
<td>12-well Tissue Culture Plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353043</td>
<td>or any other plate format.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nikon BioStation CT/IM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>or other incubator/microscope suitable for collecting video data.</td>
</tr>
<tr>
<td>CL-Quant software (Nikon) and/or Photoshop (Adobe).</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

video bioinformatics analysis of human embryonic stem cell colony growth

Como os dados de vídeo são complexos e são compostos de muitas imagens, informações de mineração a partir de material de vídeo é difícil de fazer sem o auxílio de software de computador. Vídeo bioinformática é uma poderosa abordagem quantitativa para a extração de dados espaço-temporais a partir de imagens de vídeo usando o software de computador para executar a mineração de namoro e análise. Neste artigo, apresentamos um vídeo bioinformática método para quantificar o crescimento de células estaminais embrionárias humanas (CTEh) através da análise tempo-lapso vídeos coletados em um BioStation Nikon CT incubadora equipado com uma câmera para imagens de vídeo. Em nossos experimentos, colônias CTEh que foram anexadas a Matrigel foram filmados por 48 horas no CT BioStation. Para determinar a taxa de crescimento dessas colônias, as receitas foram desenvolvidas utilizando CL-Quant software que permite aos usuários extrair vários tipos de dados a partir de imagens de vídeo. Para avaliar com precisão o crescimento da colônia, três receitas foram criadas. A primeira imagem segmentada para a colônia e de fundo, o segundo a imagem do maior para definir colônias ao longo da sequência de vídeo com precisão, eo terceiro medido o número de pixels na colônia ao longo do tempo. As três receitas foram executadas em seqüência em dados coletados em um vídeo CT BioStation para analisar a taxa de crescimento de colônias CTEh individual sobre 48 horas. Para verificar a veracidade das receitas CL-Quant, os mesmos dados foram analisados ​​manualmente, usando o software Adobe Photoshop. Quando os dados obtidos com as receitas CL-Quant e Photoshop foram comparados, os resultados foram praticamente idênticos, indicando as receitas CL-Quant eram verdadeiras. O método descrito aqui pode ser aplicado a todos os dados de vídeo para medir as taxas de crescimento de CTEh ou outras células que crescem em colônias. Além disso, as receitas outro vídeo bioinformática podem ser desenvolvidos no futuro para outros processos celulares como a migração, apoptose e adesão celular.

Watch this Scientific Journal Video about Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth at JoVE.com

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Vídeo bioinformática é o tratamento automatizado, análise, compreensão e de mineração de dados biológicos de espaço-temporal de dados extraídos de vídeos microscópica. O objetivo deste artigo é demonstrar um método para medir-tronco embrionárias humanas crescimento da colônia de células usando um método de vídeo bioinformática.

Vídeo Bioinformática Análise de Crescimento Humano embrionárias Colony Stem Cell

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

video-bioinformatics-analysis-human-embryonic-stem-cell-colony

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K visualizações.  University of California. Vídeo bioinformática é o tratamento automatizado, análise, compreensão e de mineração de dados biológicos de espaço-temporal de dados extraídos de vídeos microscópica. O objetivo deste artigo é demonstrar um método para medir-tronco embrionárias humanas crescimento da colônia de células usando um método de vídeo bioinformática.

Vídeo: Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts of cell culture, and tend to acquire karyotypic abnormalities with high population doublings.  Proper passaging is essential for maintaining a healthy, undifferentiated, karyotypically normal HuES human embryonic stem cell culture.  First, an expanding culture is washed in PBS to remove residual media and cell debris, then cells are overlaid with a minimal volume of warm 0.05% Trypsin-EDTA.  Trypsin is left on the cells for up to five minutes, then cells are gently dislodged with a 2mL serological pipette.  The cell suspension is collected and mixed with a large volume of HuES media, then cells are collected by gentle centrifugation.  The inactivated trypsin media mixture is removed, and cells resuspended in pre-warmed HuES media.  An appropriate split ratio is calculated (generally 1:10 to 1:20), and cells re-plated onto a 1-2 day old plate containing a monolayer of irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells.  The newly seeded HuES culture plate is left undisturbed for 48 hrs, then media is changed every day thereafter.  It is important not to trpsinize down to a single cell suspension, as this increases the risk of introducing karyotypic abnormalities.

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin. Brought to you by JoVE.

MATIZ Passaging-tronco embrionárias humanas Cell-linhas com Tripsina

In this video we demonstrate how our lab routinely passages HuES human embryonic stem cell lines with trypsin.  Human embryonic stem cells are artifacts ...

Biologia

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Propagação de-tronco embrionárias humanas (ES) Células

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Derivação de células estaminais embrionárias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Cromatina imunoprecipitação de células estaminais embrionárias humanas

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

Cultura e Manutenção de células estaminais embrionárias humanas

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolamento e expansão em grande escala de Adulto Humanos endotelial Colony Células Progenitoras Forming

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

Isolamento e animais de Expansão de soro livre de cordão umbilical humano Derivado células mesenquimais estromais (MSCs) e endoteliais Células Progenitoras Colony Forming (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Congelamento e descongelamento, células estaminais embrionárias humanas

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Diferenciação de células-tronco embrionárias em precursores oligodendroglial

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...