Enuclear os olhos de um camundongo eutanasiado, marcando o lado temporal para fins de orientação. Remover a câmara anterior. Em seguida, retire a lente e o vítreo e coloque os óculos em paraformaldeído por 30 minutos.
Lave os óculos com PBS por 30 minutos. Substituindo a solução três vezes. Em seguida, lave com Triton X-100 a 0,5% por 30 minutos.
Incubar os copos oculares no tampão de bloqueio por duas horas à temperatura ambiente. Após a imunomarcação, isole as retinas dos óculos usando um microscópio. Divida as retinas em quatro folhas e monte-as com a camada de células ganglionares da retina voltada para cima.
Certifique-se de que a marca no lado temporal permaneça presa para orientação. Cubra as retinas com meio de montagem. Coloque folhas de cobertura.
E sele as lâminas usando esmalte. Ligue o microscópio confocal e, no modo Localizar, encontre a área de interesse usando a ocular. Mude para o modo de aquisição e configure blocos para cobrir toda a retina, juntamente com fatias Z-Stack para todas as camadas de informações.
Imagem de pelo menos 25 blocos em toda a retina para alcançar um volume total. Projete os cortes Z-Stack para gerar imagens de microscopia confocal bidimensional na face. O fibrograma composto vis-OCT é comparado com a imagem confocal correspondente de retina plana imunomarcada com TuJ1 para axônios RGC.
Os vasos sanguíneos exibem estruturas ramificadas distinguíveis que podem ser combinadas com os vasos sanguíneos marcados com ICAM-2 na imagem confocal. A comparação lado a lado entre a microscopia confocal ex vivo e a vis-OCT in vivo revelou redes idênticas de feixes axonais RGC e vasculatura retiniana circundante.
