Para começar, tome um frasco para injetáveis contendo a medula óssea do rato, as células estaminais hematopoiéticas e as células progenitoras. Usando uma micropipeta, ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão lisante ACK e incube por um a dois minutos à temperatura ambiente. Transfira a mistura ressuspensa para um tubo de 50 mililitros através do filtro de células pré-molhado de 70 micrômetros.
Em seguida, adicione 10 mililitros de tampão FACS para diluir o tampão de lise ACK. Centrifugar a mistura a 400 G por cinco minutos a quatro graus Celsius e ressuspender o pellet em 10 mililitros de tampão FACS, primeiro ressuspendendo-o em um mililitro de tampão e, em seguida, completando com nove mililitros de tampão. Agora, misture 10 microlitros de azul de tripano a 0,4% com 10 microlitros das células em um tubo de 0,5 mililitro e conte as células usando um contador de células automatizado.
Para manchar as células, centrifugar as células a 400 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Ressuspenda o pellet em tampão FACS para atingir uma concentração final de uma vez 10 a sete células por mililitro, primeiro ressuspendendo o pellet em um mililitro de tampão e, em seguida, completando com o volume restante. Usando uma micropipeta P1000, transfira a suspensão para um tubo FACS através de uma tampa de filtro de célula de 35 micrômetros.
Em seguida, prepare a mistura de coloração como mostrado aqui. Após a centrifugação, ressuspender a suspensão celular em 300 microlitros de mistura de coloração um em um tubo de amostra e incubar sobre gelo por 15 minutos protegido da luz. Em seguida, adicione 300 microlitros de mistura dois no tubo de amostra e incube por 20 minutos em gelo protegido da luz.
Adicione três mililitros do tampão FACS aos tubos de amostra corados e misturados de forma simples. Agora centrifugar a suspensão celular. Após o descarte do sobrenadante, ressuspenda o pellet em 500 microlitros do tampão FACS.
Prepare um tubo de 1,5 mililitro pré-preenchido com 500 microlitros de meio de coleta. Uma vez que o instrumento FACS tenha sido calibrado, adicione 500 microlitros de tampão FACS à suspensão da célula e, em seguida, transfira um mililitro da amostra através de uma tampa de filtro de célula de 35 micrômetros para um novo tubo FACS. Após a classificação celular, transfira 10 microlitros das células classificadas para um novo tubo FACS contendo 90 microlitros de tampão FACS.
Pellet da célula em suspensão por centrifugação e ressuspensão em 50 microlitros de PBS com BSC 0,04%. Transfira a suspensão para um tubo de 0,2 mililitro e adicione 50 microlitros de PBS com BSA ao tubo original para coletar as células remanescentes. Transfira as células para o tubo de 0,2 mililitro para atingir um volume total de 100 microlitros.
Executar um experimento piloto para identificar o melhor tempo de lise para isolamento de núcleos. Após a peletização dos núcleos, ressuspendê-los em 12 microlitros de tampão de núcleo diluído. Adicione dois microlitros de núcleos a um tubo contendo 0,4% de azul de tripano e oito microlitros de PBS com 0,04% de BSA e conte os núcleos usando um contador de células automatizado.
Após completar o isolamento dos núcleos, transfira seis microlitros de ressuspensão de núcleos para um novo tubo FACS pré-preenchido com 150 microlitros de tampão FACS. Adicione três microlitros de 7-AAD e incube por cinco minutos no gelo.
