Os autores agradecem o aconselhamento e apoio técnico fornecido pelo Dr. Richard Konz e pessoal nas instalações Núcleo Citometria de Fluxo na Universidade de Massachusetts Medical School. Recursos suportados pelo núcleo de Endocrinologia Diabetes Research Center Grant DK032520 também foram utilizados. Este trabalho é suportado por concessões do National Institute of Mental Health (NIMH), do Instituto Nacional de Abuso de Drogas (NIDA) e do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano.

Extração de núcleos <ol><li> Colocar 250 mg de tecido congelado cérebro pós-morte em 5 mL de Lise um tampão em um douncer e colocá-lo no gelo. Para receber cerca de 5 milhões núcleos após FACS triagem, geralmente usamos 1000 mg de tecido por amostra. </li><li> Uma vez que o tecido tem descongelado, Dounce o tecido por 1 minuto enquanto no gelo. </li><li> Pegue o tecido homogeneizado e colocá-lo em um tubo de ultracentrífuga 15 mL claro. Colocar o tubo em gelo. </li><li> Tome 9 mL da solução de sacarose 2 com uma pipeta, coloque a pipeta no fundo do tubo de ultracentrífuga claro, e liberar a solução de sacarose 2 para criar um gradiente de concentração com a solução de tecido homogeneizado em cima da solução de sacarose 2. </li><li> Pesar os tubos de ultracentrífuga para se certificar de que todos eles vão ser equilibrada ao girar dentro da ultracentrífuga. Faça os ajustes para o peso pela adição de Tampão de Lise 1 para a camada superior. </li><li> Após os tubos foram pesadas, colocá-los em baldes do rotor. </li><li> Coloque todos os baldes em um rotor SW28 e coloque cuidadosamente o rotor para a ultracentrífuga. </li><li> Ultracentrífuga as amostras em 107.163,6 RCF por 2,5 horas a 4 ° C. </li><li> Uma vez que a centrifugação for concluída, remova o sobrenadante, juntamente com a camada de detritos encontrados no gradiente de concentração, com a utilização de um vácuo, tomando cuidado para não perturbar o pellet contendo os núcleos na parte inferior do tubo. </li><li> Adicionar 500 mL de 1X PBS a cada pellet e deixe descansar na geladeira por 20 minutos. Isso permite que o pellet para dissolver um pouco por conta própria, tornando mais fácil para depois dissolvê-lo mecanicamente por pipetagem cima e para baixo, o que diminui a quantidade de estresse a experiência dos núcleos. </li><li> Após os núcleos têm incubadas no gelo por 20 minutos, mecanicamente pipeta cima e para baixo para dissolver completamente os núcleos dentro 1XPBS. </li><li> Remover a solução contendo núcleos dos tubos de ultracentrifugação e combinar o conteúdo de dois tubos em um único tubo de microcentrífuga 2 mL. Novamente, coloque as amostras em gelo. </li></ol> Imunomarcação para FACS <ol><li> Neste ponto, faça uma mistura composta imunomarcação do anticorpo primário e secundário, e Bloqueio Mix. Para cada amostra, combine 300 mL de 1XPBS contendo 1,2 mL de anticorpo NeuN, 100 mL da mistura de bloqueio, que contém BSA 0,5% e soro de cabra normal em 10% 1XPBS, e 1 mL de Alexa Fluor 488. Para as amostras controle, excluir a NeuN anticorpo primário e, em vez disso, basta adicionar 1XPBS mais. </li><li> Vortex da mistura imunocoloração e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente no escuro. </li><li> Enquanto a mistura de coloração é a incubação, fazer os controles para as amostras. FACS para triagem, uma amostra, contendo núcleos só, chamado de &quot;controle sem mácula&quot; é necessário, uma segunda amostra, um controle negativo, contendo os núcleos com o anticorpo secundário Alexa Fluor 488 sem o anticorpo primário NeuN também é necessário. </li><li> ML alíquota 20 dos núcleos contendo solução para um tubo de microcentrífuga contendo 2 mL 1XPBS para o controle sem manchas, e outro 20 mL para outro tubo de 2 ml contendo 980 uL de 1XPBS para o controle negativo. Aumentar o volume dos núcleos contendo amostra de volta até 1 mL com 1XPBS. Todas as amostras são colocadas de volta no gelo. </li><li> Agora que a mistura imunocoloração terminou incubação, adicione o seu conteúdo de 401 mL em amostras adequadas. A amostra núcleos receberão a mistura contendo ambos os NeuN e Alexa Fluor 488, enquanto a amostra negativa receberá a mistura contendo apenas o anticorpo secundário Alexa Fluor 488. </li><li> Tomar as amostras para a sala fria para rodar no escuro por 45 minutos. </li><li> Depois que as amostras têm incubadas no escuro por 45 minutos, colocá-los no gelo e trazê-los para a instalação FACS. Durante o transporte para a instalação FACS, as amostras devem ser mantidas no gelo e no escuro. </li></ol> FACS <ol><li> Na instalação FACS, filtro as amostras através de um filtro de 40 um. Então, executá-los através do instrumento por alguns minutos, enquanto sendo mantido frio, a fim de obter alguns dados preliminares antes da separação. </li><li> Neste ponto, é necessário definir as portas adequadas para a classificação. Várias portas diferentes são usados ​​para amostras tipo. O primeiro portão dá uma idéia do tamanho dos núcleos diferentes encontrados dentro da amostra, e permite separatation de detritos de núcleos reais. O segundo portão nos permite classificar os núcleos individualmente. Descartar qualquer agregados são descartados neste momento. Finalmente, o terceiro portão é definido para um determinado comprimento de onda de fluorescência, correspondente ao do fluorocromo encontrada na nossa anticorpo secundário. Colocando esse portão que nos permite classificar e + NeuN separado, portanto núcleos neuronais de NeuN - núcleos. </li><li> Depois de todas as portas são escolhidos, os núcleos podem ser classificados em 1XPBS. </li><li> Uma vez que oamostra total passou, verificar a pureza da espécie, executando uma alíquota da amostra classificadas através do instrumento. Certifique-se que fluorescence da amostra não se espalha, mas é contido dentro de um único quadrante. É melhor escolher amostras que são mais de 90% pura. </li></ol> Depois FACS <ol><li> Uma vez que a amostra foi classificada, o processamento dos núcleos pode começar. Tomar 10 mL de amostra classificados e adicionar-lhe 2 mL da solução de sacarose 2, 50 uL de 1M CaCl 2 e 30 ul de 1m Mg (Ace) 2. Como um lembrete, certifique-se sempre manter a amostra em gelo desde os núcleos são corrigidos. </li><li> Se houver menos de 10 mL de amostra classificados, aumentar o volume até 10 mL, adicionando 1XPBS, ou ajustar a materiais adicionais em conformidade. </li><li> Inverter a amostra várias vezes e colocar no gelo por 15 minutos. </li><li> Após as amostras terem incubado em gelo por 15 minutos, centrifugar-los em um balde de rotor swing em 1786 RCF por 15 minutos a 4 ° C. </li><li> Desprezar o sobrenadante com o uso de um vácuo, sem perturbar o sedimento branco encontrado na parte inferior do tubo. </li><li> Dissolver o sedimento em 200 mL de qualquer solução que você precisa para os experimentos de prosseguir, e pipetar cima e para baixo. </li><li> Transferir a solução para um pequeno tubo e colocá-lo no freezer -80 ° C até à sua utilização. </li></ol>

<ol>
	<li>Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+human+cerebral+cortex+is+dynamically+regulated+throughout+the+life+span+and+involves+differentiated+neurons.">DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons.</a> PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li><li>Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+ChIP-chip+analysis+using+10,000+human+cells.">Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells.</a> Biotechniques. 43, 791-797 (2007).</li></ol>

O protocolo aqui apresentado deve ser particularmente útil para os estudos focados em mudanças epigenéticas da cromatina neuronal e, mais genericamente, sobre o fenótipo molecular do núcleo neuronal, durante a doença em desenvolvimento e envelhecimento, ou em condições normais neurológicos ou psiquiátricos. O método é uma vantagem particular quando a heterogeneidade celular de tecido do cérebro, incluindo mudanças potenciais no neurônio-glia de-ração durante o curso do envelhecimento ou devido a doenças são uma preocupaç...

Reagentes: <table><tr><th colspan="3" align="left"> 1. Tampão de Lise </th></tr><tr><td> 0.32M </td><td> Sacarose </td><td> 5,47 g </td></tr><tr><td> 5 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 250 L </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acetato) 2 </td><td> 150 mL </td></tr><tr><td> 0,1 mM </td><td> EDTA </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 10mM </td><td> Tris-HCl, PH8 </td><td> 500 mL </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> TDT </td><td> 17 mL </td></tr><tr><td> 0,1% </td><td> Triton X-100 </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Ajustar o volume para 50 ml com água esterilizada </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 2. Solução de sacarose </th></tr><tr><td> 1,8 M </td><td> Sacarose </td><td> 30,78 g </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acetato) 2 </td><td> 150 mL </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> TDT </td><td> 17 mL </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, PH8 </td><td> 500 mL </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Ajustar o volume para 50 ml com água esterilizada </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 3. Dounce tampão </th></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris </td><td> 0,242 g </td></tr><tr><td> 4 mM </td><td> MgCl 2 </td><td> 0,163 g </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 0,03 g </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Ajustar o pH para 7,5 e volume para 200 ml com água esterilizada </td></tr></table>

neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue

Neurônios no cérebro humano se tornar pós-mitóticos em grande parte durante o desenvolvimento pré-natal, e assim manter seus núcleos em todo o ciclo de vida completo. No entanto, pouco se sabe sobre as alterações na cromatina nuclear neuronal e na organização durante o curso do desenvolvimento e envelhecimento, ou doença neuropsiquiátrica crônica. No entanto, a data mais cromatina e DNA ensaios com base (que não FISH) a falta de resolução única célula. Para este fim, a uma considerável heterogeneidade celular de tecido cerebral representa uma limitação significativa, porque normalmente várias subpopulações de neurônios são misturados com diferentes tipos de células gliais e outras células não-neuronais. Uma possível solução seria a crescer células tipo culturas específicas, mas a maioria das células do SNC, incluindo os neurônios, são ex vivo sustentável, na melhor das hipóteses, por apenas algumas semanas e assim proporcionaria um modelo incompleto de mecanismos epigenéticos potencialmente operacional em todo o ciclo de vida completo . Aqui, nós fornecemos um protocolo para extrair e purificar a partir de núcleos congelados do cérebro pós-morte (nunca fixo) humana. O método envolve a extração de núcleos em tampão de lise hipotônica, seguido por ultracentrifugação e immunotagging com anti-NeuN anticorpos. Rotulados núcleos neuronais são então recolhidos separadamente usando fluorescência ativado classificação. Este método deve ser aplicável a qualquer região do cérebro em uma ampla gama de espécies e adequado para estudos de imunoprecipitação de cromatina com local e modificação específica anticorpos anti-histonas, e para a metilação do DNA e outros ensaios.

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Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

A heterogeneidade celular de tecido cerebral representa uma limitação significativa para o estudo de marcas epigenéticas na cromatina porque a maioria dos ensaios falta de resolução única célula. Neurônios são normalmente misturados com glia e outras células não-neuronais. Nós fornecemos um protocolo para extrair e coletar núcleos neuronal do cérebro humano.

Isolamento Núcleos neuronais de Tecidos Humanos Postmortem Cérebro

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

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22.0K visualizações.  University of Massachusetts Medical School. A heterogeneidade celular de tecido cerebral representa uma limitação significativa para o estudo de marcas epigenéticas na cromatina porque a maioria dos ensaios falta de resolução única célula. Neurônios são normalmente misturados com glia e outras células não-neuronais. Nós fornecemos um protocolo para extrair e coletar núcleos neuronal do cérebro humano.