Após a autoclavagem de duas placas de silicone, em condições estéreis, retire as placas do saco de autoclave e coloque-as em placas de 150 milímetros. Adicione 400 microlitros de solução de fibronectina a cada poço das placas de silicone. Em seguida, ressuspenda as células estromais mesenquimais induzidas positivas para escleraxis em meio MSC e conte as células viáveis usando um contador de células automatizado.
Calcular o volume de suspensão celular necessário para obter 1,25 vezes 10 a quarta células por centímetro quadrado. Remova esse volume de meio de estiramento MSC do tubo cônico de 15 mililitros e adicione o volume necessário de suspensão de células estromais mesenquimais induzidas positivas para escleraxis. Inverter o tubo para homogeneidade da nova suspensão celular.
Adicione 400 microlitros de suspensão celular a cada poço de ambas as placas de silicone. Coloque a tampa de volta nas placas de 150 milímetros e incube as placas a 37 graus Celsius por 24 horas. Para tensão uniaxial, enxaguar o aparelho de alongamento com água bidestilada, seguida de etanol 70%.
Limpe o aparelho, coloque-o na capa de cultura celular e exponha à luz ultravioleta por 15 minutos. Em seguida, coloque uma placa na incubadora como controle estático. Coloque a segunda placa de silicone assentada no aparelho de alongamento, alinhando os parafusos com os orifícios na placa de silicone.
Em seguida, coloque a tampa sobre o aparelho. Fixe o aparelho com a placa de silicone sentada à fonte eletrônica e coloque-o na incubadora a 37 graus Celsius. Defina o programa de alongamento cíclico para 4% de tensão senoidal em 0,5 hertz por duas horas por dia.
Inicie o alongamento pressionando o botão Iniciar. Durante a carga mecânica de células estromais mesenquimais induzidas por escleraxia positiva, densidades de semeadura excessivamente altas levaram à contração prematura das células e morte celular precoce. Após vários dias de alongamento, algum grau de organização celular foi observado no grupo estromais de células mesenquimais induzidas induzidas por escleraxis-positiva, em comparação com a organização celular aleatória no grupo estático.
A coloração com faloidina dos filamentos de actão mostrou que as células cresceram perpendicularmente à direção do estiramento, em contraste com a organização celular aleatória observada nas placas estáticas. A análise da expressão gênica revelou um aumento significativo na regulação de genes tenogênicos em três e sete dias, em comparação com apenas os IMSCs no dia zero. A deposição de colágeno na média após sete dias de alongamento foi significativamente maior no grupo estromais de células mesenquimais estromais induzidas induzidas por escleraxia estirado em comparação com todos os outros grupos.
