O protocolo a seguir fornece instruções para gerar células-tronco pluripotentes autoólogas induzidas pelo homem através da rápida e eficiente reprogramação de fibroblastos dérmicos humanos isolados de uma biópsia de socos na pele. Os procedimentos podem ser realizados por pesquisadores com pouca ou nenhuma experiência em reprogramação celular e com ajuste adequado, permite o produto de células-tronco pluripotentes induzidas livres de xenoenvolvidas. Células IPS autólogas podem ser usadas para aplicações de medicamentos regenerativos e para modelar doenças como distúrbios genéticos ou câncer para investigar mecanismos moleculares subjacentes e desenvolver terapias mais específicas.
A carga de trabalho é alta. É extremamente útil estudar o protocolo antes de planejar cuidadosamente o experimento, incluindo as etapas durante as quais os reagentes e materiais devem ser preparados. A demonstração visual do procedimento ajuda as pesquisas com pouca ou nenhuma experiência a realizar o isolamento celular e a reprogramação, evitando erros comuns relacionados a possíveis contaminações microbianas e de RNA.
Sob um capô estéril, lave a amostra recém-obtida da pele humana do abdômen em um prato de 100 milímetros com solução HPSS. Remova o cabelo e a gordura usando fórceps finos e tesouras e disseca-o com um bisturi para obter fragmentos do tamanho de dois milímetros por um milímetro, evitando cicatrizes, áreas sujas ou queimadas do tecido. Coloque quatro pequenos fragmentos em cada prato de 35 milímetros, cubra com um vidro de cobertura estéril e adicione 1,5 milímetros de I-DMEM.
Incubar as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por cerca de 15 dias ou até que as células atinjam 85% de confluência. Mude o meio de cultura a cada três dias e verifique o crescimento das células usando um microscópio de contraste de fase invertida diariamente. Agora, levante os óculos de cobertura com fórceps finos, coloque-os de cabeça para baixo em um prato de 100 milímetros e lave com PBS estéril de 1X.
Remova os fragmentos das amostras e descarte-os. Lave placas com PBS estéril 1X. Remova o PBS 1X e adicione três milímetros de Trypsin-EDTA aos copos de cobertura colocados no prato de 100 milímetros e adicione um milímetro de Trypsin-EDTA aos pratos de 35 milímetros também.
Incubar por cinco minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Em seguida, bloqueie a trippsinização adicionando cinco milímetros de TSS ao prato de 100 milímetros e dois milímetros de TSS a cada prato de 35 milímetros. Colete a suspensão em tubos estéreis de 15 milímetros, centrífuga a 400 vezes G a quatro graus Celsius por cinco minutos.
Aspire o supernasce e resuspenda a pelota em 12 milímetros de I-DMEM. Divida a suspensão da célula em alíquotas de três milímetros e transfira cada uma delas para uma placa de 60 milímetros. Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Mude o meio diariamente. Mantenha as células na cultura até atingirem uma confluência de 75% Depois disso, repita a trippsinização três vezes para obter células que passam quatro. Em seguida, sincronize as células substituindo o I-DMEM por S-DMEM e incubar por 48 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Durante a sincronização celular, prepare o coquetel de reprogramação de RNA de expansão do fibroblasto médio e total não modificado para programação livre de fibroblastos. Para simplificar a preparação dos nove tubos de alíquotas de RNA não modificadas que são então divididas em 36, costumávamos seguir um esquema que anexamos à parede do capô. Cubra uma placa de 24 poços transferindo 100 microliters da matriz de membrana do porão descongelada no gelo para cada poço para cobrir uniformemente o fundo.
Incubar por pelo menos uma hora a 37 graus Celsius antes de semear as células. Aspire o meio a partir de placas com células em cultura e lave rapidamente em 1X PBS. Repita a trippsinização para obter células que passarem cinco.
Aspire o supernasce e resuspenda a pelota em um volume apropriado de meio de expansão do fibroblasto. Prepare e limpe o hemócito com 70% de álcool. Em seguida, prepare uma solução misturando suavemente 10 microliters de azul tripano e 10 microliters de suspensão celular em um tubo de 1,5 mililitro, e incubar por um a dois minutos à temperatura ambiente.
Pipeta 10 microlitros da solução no hemótmetro e colocá-la no estágio de um microscópio de contraste de fase invertida para contar. As células não viáveis são azuis enquanto as células viáveis não estão manchadas. Conte as células em pelo menos dois quadrados da câmara hemótmica.
Realize uma diluição para obter uma densidade de 2,5 vezes 10 a 10 para as quatro células por 500 microliters de meio de expansão do fibroblasto e resuspende a pelota celular. Pipeta 500 microliters da suspensão celular em cada poço da placa de 24 poços. Incubar células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Pela manhã, remova o antigo meio de cada poço e substitua-o por 500 microliters de meio de cultura livre de fators pré-zarmed xeno-free. Incubar a 37% graus Celsius abaixo de 5% de dióxido de carbono por pelo menos seis horas. Descongele cinco alíquotas de 15,4 microliter de coquetel total de reprogramação de nmRNA à temperatura ambiente e coloque-os no gelo.
Adicione 234,6 microliters de meio soro reduzido a cada alíquota, pipeta suavemente três a cinco vezes e rotule cada um como tubo A.Rotule cinco tubos RNase livres de RNase estéreis como tubo B e misture seis microliters de reagente de transfecção RNA de pequeno interfere sintético com 244 microliters de meio soro reduzido. Em seguida, use pipetas para adicionar o conteúdo de cada tubo B a um tubo A gota sábia. Misture tocando na parte inferior do tubo.
Incubar em temperatura ambiente por 15 minutos. Depois disso, para adicionar 125 microliters de solução de complexo de transfecção nmRNA de cada uma das cinco alíquotas para cada poço, incline a placa e a pipeta caiam no meio. Misture o conteúdo nos 20 poços balançando suavemente.
Use os quatro poços restantes como referência. Incubar a placa por 15 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, aspire o meio.
Sob o capô estéril, repita o procedimento de transfecção, como no primeiro dia, todos os dias por mais três dias. No quinto dia, aspire o meio e troque com o fresco, pré-aquecido XF/FF Culture Medium sob um capô estéril. Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Monitore a cultura celular diariamente por um microscópio de contraste de fase, até observar a formação de colônias de IPSC. O objetivo deste protocolo foi reprogramar os fibroblastos dermais isolados da pele abdominal utilizando método de reprogramação não integrador. Os fibroblastos humanos superaram amostras de pele abdominal dentro de uma semana de cultura e atingiram 85% de confluência em duas semanas.
As células foram caracterizadas pelo crescimento adesivo em pratos da cultura plástica, e sua morfologia variou de alongado e em forma de fuso a achatado e em forma de estrela. A morfologia do fibroblasto e o arranjo e a cultura mudaram drasticamente após a semeadura da BMM, quando adquiriram uma morfologia alongada e organizaram-se para formar estruturas ramificadas finas. Pequenas colônias já eram visíveis na cultura no primeiro dia desde a primeira transfecção e seu tamanho cresceu progressivamente ao longo do tempo, enquanto seu número aumentou até o sétimo dia e depois permaneceu estável entre o sétimo dia e o dia 14, provavelmente como resultado de colônias menores se fundindo para formar colônias maiores.
Uma vez que o procedimento de reprogramação foi realizado utilizando-se mídia livre de antibióticos, no caso em que as condições estéreis não eram garantidas, a contaminação microbiana tornou-se um grande problema. A taxa de proliferação e a densidade de revestimento impactam a eficiência de reprogramação, por isso é importante planejar a passagem celular e definir a densidade de revestimento com base na taxa de proliferação celular. Substituindo reagentes derivados de animais por reagentes livres de xenônio apropriados, este protocolo permite a reprogramação de fibroblastos humanos adultos em células IPS em um ambiente de cultura completa livre de xeno que não eram seu uso clínico.
As células humanas são uma fonte potencial de infecção com patógenos transmitidos pelo sangue, portanto, equipamentos de proteção individual devem ser usados durante todo o procedimento.
