O Escritório de Laboratórios de Ciência e Engenharia da FDA está desenvolvendo ferramentas científicas regulatórias para ajudar os desenvolvedores de dispositivos médicos e revisores da FDA. Nosso objetivo final é acelerar o acesso do paciente a dispositivos médicos inovadores, seguros e eficazes por meio da melhor ciência disponível. Neste protocolo, aplicamos tecnologia de ponta de células-tronco pluripotentes induzidas na avaliação de dispositivos médicos que são usados para tratar condições cardíacas potencialmente fatais.
Esta ferramenta simples permite a avaliação reprodutível de dispositivos de eletrofisiologia cardíaca na placa usando equipamento padrão de laboratório. Ele também pode ser usado com células específicas do paciente derivadas de doadores com várias doenças cardíacas. Para começar, plaqueie os cardiomiócitos humanos derivados de iPSC descongelados em placas estéreis de seis poços revestidas com gelatina a 0,1% pelo menos dois dias antes da semeadura dos cardiomiócitos no substrato hidrogel flexível.
Cultive os cardiomiócitos derivados de iPSC humanos em meio cardiomiócito padrão por dois a quatro dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir que eles se recuperassem da criopreservação. Refrescar o meio gasto com meio 100% cardiomiócito a cada 48 horas. Verifique o estado dos cardiomiócitos derivados da iPSC humana antes da dissociação, avaliando a saúde das células, garantindo a viabilidade e o batimento estável.
Lave os cardiomiócitos com quatro mililitros por poço de DPBS sem cloreto de cálcio ou cloreto de magnésio. Adicione um mililitro de reagente de dissociação da temperatura ambiente a cada poço e incube por 15 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio cardiomiócito a um tubo cônico estéril de 15 mililitros.
Dissociar os cardiomiócitos das placas de seis poços com uma pipeta de 1.000 microlitros e adicionar a suspensão celular ao tubo cônico. Lave os poços com um mililitro de meio cardiomiócito fresco para coletar quaisquer cardiomiócitos residuais e adicione-os ao tubo cônico. Em seguida, traga o volume final do tubo cônico para 15 mililitros com o meio.
Centrifugar o tubo a 200 G por cinco minutos e remover o sobrenadante até a marca de um mililitro. Ressuspender as células no meio cardiomiócito até um volume final de cinco mililitros e contar os cardiomiócitos com um contador celular manual ou automatizado. Em seguida, incubar a suspensão de células de cardiomiócitos por cerca de 30 minutos à temperatura ambiente enquanto os substratos flexíveis de hidrogel são preparados.
Prepare uma pipeta de 20 microlitros ajustada em um microlitro, pontas de pipeta, uma placa de fundo de vidro estéril de 48 poços e um temporizador de cronômetro no capuz de cultura de tecidos. Misture a matriz extracelular ou o substrato de hidrogel à base de ECM, batendo suavemente no tubo e colocando-o imediatamente de volta no gelo. Inicie o cronômetro imediatamente antes de chapear o primeiro substrato de hidrogel e marque-o como tempo zero.
Pipetar um microlitro do substrato de hidrogel para cima e para baixo aproximadamente três vezes para arrefecer a ponta da pipeta. Em seguida, aplique aproximadamente um microlitro do substrato de hidrogel não diluído horizontalmente no fundo de cada poço na placa de 48 poços, segurando a pipeta em um ângulo de 45 graus. Chapear todos os substratos de hidrogel na mesma orientação em cada poço para ajudar a identificar o substrato ao realizar os experimentos com ampliação de 40X.
Coloque a tampa na placa de 48 poços e deixe os substratos de hidrogel incubarem por oito a 10 minutos à temperatura ambiente na capela de cultura de tecidos antes de adicionar as células. Após a incubação, semear imediatamente os cardiomiócitos diretamente nos substratos do hidrogel com aproximadamente 30.000 cardiomiócitos viáveis por poço em um volume médio baixo de aproximadamente 200 microlitros de meio cardiomiócito. Após o fechamento da pálpebra, deixe os cardiomiócitos incubarem sem serem perturbados por 10 a 15 minutos à temperatura ambiente no capô para permitir que as células adiram ao substrato do hidrogel.
Adicione suavemente 100 microlitros de meio cardiomiócito fresco a cada poço. Coloque a tampa fechada em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois a quatro dias. Ligue o microscópio e a câmara de controle ambiental para equilibrar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Remova o meio cardiomiócito da placa de 48 poços e lave suavemente cada poço duas vezes com 600 microlitros da modulação da contratilidade cardíaca ou meio de ensaio CCM. Em seguida, adicione 300 microlitros de meio de ensaio CCM por poço e coloque a placa de 48 poços no microscópio na câmara de controle ambiental. Insira os eletrodos e equilibre as células por cinco minutos.
Para gravar os vídeos de contração usando microscopia baseada em vídeo, abra o software de gravação de vídeo e defina uma taxa de quadros de 100 quadros por segundo. Em seguida, selecione uma região de interesse ou ROI perto do centro da monocamada hiPSC-CM. Em seguida, o campo estimula as células com um gerador de pulso comercial para acelerar eletricamente as monocamadas de cardiomiócitos 2D.
Coloque o cardiomiócito no limiar de 1,5 vezes um hertz com os parâmetros basais de pulso. Por exemplo, pulsos monofásicos de onda quadrada com uma duração de pulso de estímulo de dois milissegundos de cinco volts. Grave o vídeo de contração apenas do ritmo de linha de base antes do CCM por um mínimo de cinco batidas.
Em seguida, estimular a monocamada de cardiomiócitos com um sinal elétrico experimental de 30 milissegundos de atraso, dois pulsos bifásicos simétricos de 5,14 milissegundos de duração de fase, com duração total de 20,56 milissegundos, amplitude de fase de 10 volts e intervalo interfásico zero. Grave o vídeo de contração induzida por CCM por um mínimo de cinco batimentos. Desligue o sinal CCM, estimule com um pulso de estimulação basal e grave um vídeo de contração do período de recuperação após o CCM por um mínimo de cinco batimentos.
Use um software de contração padrão para analisar os vídeos de contração automaticamente e quantificar as principais propriedades contráteis, como amplitude de contração, inclinação de contração, inclinação de relaxamento, tempo para pico, tempo para a linha de base 90% e duração da contração 50%As propriedades contratuais da monocamada de cardiomiócitos derivadas da iPSC humana 2D foram caracterizadas e os parâmetros-chave da contratilidade dos cardiomiócitos foram quantificados. A aplicação dos parâmetros padrão de estimulação da CCM resultou em propriedades contráteis melhoradas in vitro. Os efeitos da modulação das concentrações de cálcio extracelular sobre as propriedades contráteis humanas com e sem estimulação da CMC foram avaliados.
A dependência basal esperada de cálcio da contração foi observada, bem como um aumento induzido por CCM na sensibilidade ao cálcio ao nível da monocamada de cardiomiócitos. Além disso, o interrogatório farmacológico da via de sinalização betaandrogênica revelou que os efeitos inotrópicos induzidos por CCM foram, em parte, mediados pela sinalização beta adrenérgica. Além disso, essa ferramenta pode ser expandida para cardiomiócitos de doenças específicas do paciente, incluindo aqueles de cardiomiopatia dilatada para entender o efeito da CCM no contexto de estados de doença.
Aqui, nos concentramos principalmente na avaliação das propriedades contráteis humanas. No entanto, usando essa ferramenta, pode-se também avaliar outras leituras de acoplamento de contração de excitação cardíaca, incluindo potenciais de ação e manuseio de cálcio. Esta é a primeira ferramenta científica regulatória a combinar células-tronco pluripotentes induzidas por tecnologia com avaliação de dispositivos cardíacos.
Este método alternativo abre caminho para que os dispositivos médicos sejam avaliados em um prato e tem o potencial de reduzir a necessidade de testes em animais e seres humanos.
