Para desenvolver um método LC-TIMS ToF MS/MS para análise de peptídeos de histonas proteolíticas, acople uma HPLC equipada com uma coluna C-18 com um instrumento comercial TIMS ToF MS com tecnologia passiva proprietária. Em seguida, ajuste as condições de operação de ionização por nanoeletrospray para tensão capilar de 4, 500 volts, deslocamento da placa final de 800 volts, pressão do nebulizador de três barras, gás seco de 10 litros por minuto e aquecedor seco de 200 graus Celsius. Configure as configurações do MS para seis energia de colisão elétron-volt, 1200 VPP de colisão RF, tempo de transferência de 75 microssegundos e armazenamento pré-pulso de cinco microssegundos.
Ajustar o volume de injeção para 20 microlitros, correspondendo a oito microgramas da amostra, e ajustar a taxa de fluxo para 0,4 mililitros por minuto. Depois de inserir a linha do tempo de gradiente especificada e o teste de acetonido com porcentagens de ácido fórmico de 0,1%, selecione OK em ambas as caixas pop-up para salvar o método. Executar um gradiente não linear de CL de 60 minutos usando água e acetonitrila, ambos com ácido fórmico a 0,1%.
Verificar a eluição da amostra da HPLC para o ToF TIMS via ionização por nanoeletrospray no modo de ionização positiva. Para identificar sequências peptídicas e sítios de modificação sob a ferramenta MS-Digest, gere uma lista teórica de peptídeos usando o Protein Prospector. Em seguida, realize um digesto teórico considerando as condições de digestão, o tipo de modificações pós-traducionais, a faixa de tamanho do peptídeo, a faixa de detecção de massa e o número potencial de clivagens perdidas.
Para analisar os dados adquiridos, procure as massas em vários estados de carga, variando de mais um a mais quatro, para cada peptídeo teórico. Depois de identificar cada relação massa/carga, selecione o pico e confirme o MSMS usando uma lista teórica de íons de fragmentação baseada na sequência peptídica. Incluindo modificações pós-traducionais.
Os espectros de fragmentação dos peptídeos revelaram três diferentes variantes peptídicas com várias modificações pós-transcricionais, incluindo grupos propionil e acetila, em diferentes posições. O padrão H3 de histona propionilado exibiu peptídeos mais longos do que a versão não modificada. As histonas extraídas das células HeLa S3 apresentaram múltiplos padrões de modificação pós-traducional nas mesmas posições de aminoácidos.
