Para começar, tome culturas de Pseudomonas aeruginosa cultivadas por 24 horas. Em seguida, ajuste sua densidade óptica em 600 nanômetros para 0,2 e faça diluições adequadas usando 0,8% de soro fisiológico. Com uma alça de arame estéril, passe a cultura bacteriana na placa de ágar CAS.
Incubar a placa de ágar CAS a 30 graus Celsius por 24 horas. Transfira a cultura para uma placa de microtitulação de 96 poços e meça a densidade óptica a 600 nanômetros. Em seguida, transfira as culturas para tubos de centrífuga.
Centrifugar a cultura bacteriana a 4650 g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Pipetar 100 microlitros do sobrenadante livre de células e adicioná-lo a um poço de uma placa de 96 poços. Em seguida, adicione 100 microlitros de corante CAS ao poço.
Cubra a placa com papel alumínio antes da incubação. Após a incubação, faça leituras espectrofotométricas a 630 nanômetros e calcule a quantidade total de sideróforos como unidade de sideróforo percentual. Pipetar 100 microlitros do sobrenadante livre de células em uma placa de microtitulação de 96 poços.
Em seguida, adicione 100 microlitros de ácido tris-clorídrico. Medir a leitura espectrofotométrica da solução a 405 nanômetros. Para a extração de pioquelina, primeiro, pipetar 100 mililitros de culturas de 48 horas cultivadas de Pseudomonas aeruginosa em tubos de centrífuga.
Centrifugar as culturas a 4650 g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione cinco mililitros de ácido cítrico molar ao sobrenadante. Adicionar 50 mililitros de acetato de etila à solução para extrair piochelina.
Filtrar a fase orgânica com sulfato de magnésio através de um filtro de seringa. Em seguida, armazene a fase orgânica a menos 20 graus Celsius. Por fim, faça leituras espectrofotométricas a 320 nanômetros.
Os três isolados clínicos e a cepa de referência, PAO1, desenvolveram halo alaranjado claro quando cultivados em ágar CAS, indicativo de produção de sideróforos. Foram observadas diferenças significativas entre a produção total de sideróforos do isolado J3 e da PAO1. As análises espectrofotométricas do extrato de pioverdina apresentaram um pico confirmatório em 380 nanômetros.
Enquanto todos os isolados foram positivos para a produção de pioverdina, MR1 e J3 apresentaram menor produção em relação à cepa de referência. A presença de pioquelina foi confirmada por um pico de 320 nanômetros. Todos os três isolados clínicos produziram volumes significativamente maiores em comparação com a PAO1.
