저자는 DBT - Biotechnology Teaching Program, DBT - BUILDER Program 및 FIST의 자금 지원을 인정합니다. SHODH에서 받은 MR 감사 펠로우십. HP는 CSIR로부터 받은 펠로우십에 감사를 표합니다.

녹농균의 모든 박테리아 분리물은 인도 바도다라(Vadodara)와 자이푸르(Jaipur)의 의학 미생물학 실험실에서 얻었다. 선택된 모든 임상 분리물은 생물 안전 캐비닛(BSL2)에서 처리되었으며 실험 중 박테리아 분리물을 취급하는 동안 최대한의 주의를 기울였습니다. 모든 시약/용액의 상업적 세부 사항은 재료 표에 나와 있습니다.
1. Chrome Azurol Sulfonate (CAS) 염료 및 한천 배지의 제조
<ol><li>다음 조성으로 CAS 염료 (100mL)를 준비하십시오.<ol><li>CAS 60mg을 증류수 50mL에 녹입니다(용액 1).</li>
		<li>2.7mg의 FeCl3·6H2O를 10mM HCl 10mL에 녹입니다(용액 2).</li>
		<li>세트리모늄 브로마이드(Cetrimonium bromide, HDTMA) 73mg을 증류수 40mL(용액 3)에 녹입니다.</li>
		<li>솔루션 1, 솔루션 2 및 솔루션 3을 조심스럽게 혼합합니다. 유리병에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>아래 단계에 따라 CAS 한천을 준비합니다.<ol><li>100mL의 MM9 염 용액을 750mL의 증류수에 추가합니다.</li>
		<li>피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)(PIPES) 유리산 32.24g을 녹입니다.</li>
		<li>우뭇가사리 15g을 넣는다. 오토클레이브하고 식히십시오.</li>
		<li>멸균 카사미노산 용액 30mL와 멸균 20% 포도당 용액 10mL를 혼합물에 추가합니다.</li>
		<li>CAS 염료 100mL를 넣고 섞은 후 무균 상태로 붓는다. 참고: MM9 배지, 카사미노산 용액 및 8-하이드록시퀴놀린의 제조는 보충 파일 1에 나와 있습니다. PIPES 버퍼는 pH에 민감합니다. pH 5.6에 도달할 때까지 녹지 않습니다. PIPES가 물에 용해되기 시작하면 pH가 더욱 낮아지기 때문에 pH를 지속적으로 모니터링해야 합니다. 클로로포름에 용해된 3% 8-하이드록시퀴놀린과 동일한 부피의 카사미노산을 추출합니다. 혼합되지 않는 용액을 4°C에서 약 20분 동안 그대로 두고 하상을 방해하지 않고 용액의 상부를 조심스럽게 수집합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. siderophores 생산의 정성적 분석
<ol><li>녹농균의 24시간 배양에 대해 OD600nm를 0.2로 설정합니다.</li>
	<li>멸균 와이어 루프를 사용하여 CAS 한천 플레이트에 박테리아 배양액을 줄무늬로 만듭니다.</li>
	<li>30 °C에서 24 시간 동안 배양합니다. 참고: 펩톤수 배지 또는 0.8% 생리식염수를 사용하여 박테리아 배양을 희석할 수 있습니다. 24 시간 동안 박테리아 성장이 관찰되지 않으면 CAS 플레이트를 48-72 시간 동안 배양합니다.</li>
</ol>3. 전체 siderophore의 정량적 추정
<ol><li>OD600 nm를 0.25로 조정한 후 펩톤 물 배지에서 녹농균의 24시간 배양물을 다시 접종하고 30°C에서 48시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>48시간 후 실온에서 4650 x g 에서 10분 동안 박테리아 배양액을 원심분리합니다.</li>
	<li>원심분리 후 100μL의 cell-free 상층액을 96웰 마이크로타이터 플레이트에 추가하고 여기에 100μL의 CAS 염료를 추가합니다.</li>
	<li>알루미늄 호일로 접시를 덮고 실온에서 20분 동안 배양합니다.</li>
	<li>배양 후 630nm에서 분광 광도계 판독값을 취합니다.</li>
	<li>전체 사이드로포어의 정량화를 위해 얻은 결과를 PSU(Percent Siderophore Unit)로 계산합니다. 참고: PSU는 [(Ar - As)/Ar] x 100으로 계산할 수 있습니다. 여기서, Ar = 630nm에서 기준의 흡광도,S = 샘플의 cell-free 상층액의 흡광도. 참고로 CAS 염료는 접종되지 않은 펩톤 물 매체에 첨가해야 합니다. 시험관, 플라스크 등과 같은 모든 유리 용기에 6M HCl을 2시간 동안 채우고 증류수로 두 번 헹구어 철분을 제거합니다.</li>
</ol>4. 피오버딘의 정량적 추정
<ol><li>OD600nm를 0.25로 조정한 후 펩톤 물 배지에서 녹농균의 24시간 성장 배양물을 다시 접종하고 30°C에서 48시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>48시간 후 더 진행하기 전에 박테리아 성장의 OD600nm 를 측정합니다.</li>
	<li>실온에서 4650 x g 에서 10분 동안 박테리아 배양액을 원심분리합니다.</li>
	<li>원심 분리 후 100 μL의 무 세포 상청액을 96 웰 마이크로 타이터 플레이트에 추가하고 100 μL의 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)을 첨가합니다.</li>
	<li>OD405 nm에서 분광광도계를 측정합니다.</li>
</ol>5. Pyochelin 적출과 분광광도법
<ol><li>OD600nm를 0.25로 조정한 후 King's B 배지(보충 파일 1)에서 녹농균의 24시간 성장 배양물을 재접종하고 30°C에서 24시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>24시간 후 배양액 100mL를 취하고 실온에서 10분 동안 4650 x g 으로 원심분리합니다.</li>
	<li>원심분리 후 상층액에 1M 구연산 5mL를 첨가합니다. 에틸 아세테이트 50mL로 두 번 추출합니다.</li>
	<li>주사기 필터를 통해 황산 마그네슘으로 유기상을 여과합니다. 여과된 유기상을 -20°C에서 보관합니다.</li>
	<li>320nm에서 분광광도계를 측정합니다. 알림: 파이오쉐린은 실온에서 매우 불안정한 화합물이므로 얼음에서 추출 과정을 수행하십시오. 필터 분리를 위해 50mL 멸균 주사기를 사용합니다. 주사기 끝에 솜을 놓고 황산마그네슘 1g을 넣습니다. 주사기 끝에 멸균 주사기 필터를 고정하고 멸균 튜브에 여과액을 수집합니다.</li>
</ol>

녹농균 분리체(Pseudomonas aeruginosa Isolates)의 Siderophore 생산 평가

<ol>
	<li>Wang, J., Pontopolous, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+iron+cellulatar+metabolism.">Regulation of iron cellulatar metabolism.</a> Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).</li><li>Schalk, I., Perraud, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+and+its+multiple+strategies+to+access+iron.">Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron.</a> Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).</li><li>Ghssein, G., Ezzeddine, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+Pseudomonas+aeruginosa+metallophores:+Pyoverdine,+pyochelin+and+pseudopaline.">A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline.</a> Biology. 11 (12), 1711 (2022).</li><li>Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+iron+homeostasis+in+pseudomonas+aeruginosa+and+emerging+therapeutics+directed+to+disrupt+this+vital+process.">Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process.</a> Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).</li><li>Cornelis, P., Dingemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+adapts+its+iron+uptake+strategies+in+function+of+the+type+of+infections.">Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).</li><li>Lin, J., Cheng, J., Shen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pseudomonas+quinolone+signal+(pqs):+Not+just+for+quorum+sensing+anymore.">The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).</li><li>Sass, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermicrobial+interaction:+Aspergillus+fumigatus+siderophores+protect+against+competition+by+pseudomonas+aeruginosa.">Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).</li><li>Dao, K. -. H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine+production+by+pseudomonas+aeruginosa+exposed+to+metals+or+an+oxidative+stress+agent.">Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent.</a> Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).</li><li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine+siderophores:+From+biogenesis+to+biosignificance.">Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li><li>Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+of+the+nonribosomal+peptide+synthetase+pvdd+from+pseudomonas+aeruginosa.">Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).</li><li>Geum-Jae-Jeong, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+virulence+attenuation+by+inhibiting+siderophore+functions.">Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).</li><li>Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switching+between+apparently+redundant+iron-uptake+mechanisms+benefits+bacteria+in+changeable+environments.">Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments.</a> Biological Sciences. 280 (1764), 20131055 (2013).</li><li>Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isochorismate+synthase+(pcha),+the+first+and+rate-limiting+enzyme+in+salicylate+biosynthesis+of+pseudomonas+aeruginosa.">Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).</li><li>Schwyn, B., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+chemical+assay+for+the+detection+and+determination+of+siderophores.">Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.</a> Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).</li><li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+blue+agar+cas+assay+for+siderophore+detection.">Use of blue agar cas assay for siderophore detection.</a> Journal of Microbiology &amp; Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li><li>Arora, N. K., Verma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+microplate+method+for+rapid+and+efficient+estimation+of+siderophore+produced+by+bacteria.">Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria.</a> 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).</li><li>Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+microplate+method+(biolog+mt2)+for+detection+of+fusarium+fungicides+resistance/sensitivity.">Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).</li><li>Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+biology+of+pyoverdines,+pseudomonas+primary+siderophores.">Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores.</a> Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).</li><li>Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+metal+specificity+of+the+pseudomonas+aeruginosa+pyoverdine-iron+uptake+pathway.">New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway.</a> Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).</li><li>Brandel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+siderophore+of+pseudomonas+aeruginosa:+Physicochemical+characterization+of+the+iron(iii),+copper+(ii)+and+zinc+(ii)+complexes.">a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes.</a> Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).</li><li>Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+methods+and+protocols.">Pseudomonas methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).</li><li>Cunrath, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogen+pseudomonas+aeruginosa+optimizes+the+production+of+the+siderophore+pyochelin+upon+environmental+challenges.">The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges.</a> Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).</li><li>Ji, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+sensitive+LC/MS/MS+method+for+quantification+of+pyochelin+in+human+sputum+samples+from+cystic+fibrosis+patients.">A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients.</a> Biomarkers &amp; Applications. 4 (1), 135 (2019).</li><li>Visaggio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+luminescent+biosensor+for+the+microvolumetric+detection+of+the+pseudomonas+aeruginosa+siderophore+pyochelin.">A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin.</a> ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).</li><li>Miethke, M., Marahiel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore-bases+iron+acquisition+and+pathogen+control.">Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).</li><li>Il, J. M. R., Lin, Y. -. M., Lu, Y., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+and+syntheses+of+siderophores,+microbial+iron+chelators,+and+analogs+as+potential+drug+delivery+agents.">Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents.</a> Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).</li></ol>

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이 프로토콜을 통해 연구자들은 박테리아 cell-free 상층액에서 총 siderophore와 P. aeruginosa의 두 가지 다른 siderophore, 즉 pyoverdine 및 pyochelin을 정량할 수 있습니다. CAS 한천 플레이트 분석에서 CAS 염료와 Fe3+ 이온은 복합체를 형성합니다. 박테리아가 siderophore를 생성할 때 CAS-Fe3+ 복합체에서 Fe3+ 이온을 소멸시켜 박테리아 성장 주변의 색상 변화를 유도합니다. 이 변화는 박...

유기체는 전자 수송 및 DNA 복제와 같은 다양한 필수 기능을 수행하기 위해 철분을 필요로 합니다1. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 그람 음성 기회 병원체로, 숙주에 감염을 일으키는 다양한 독성 인자를 가지고 있는 것으로 알려져 있으며, 그 중 한 가지 기전이 사이드로포어 형성(siderophore formation)이다2. 녹농균(P. aeruginosa )은 철분이 고갈되는 동안 시데로포어(siderophores)라고 하는 특수 분자를 방출하여 주변 환경으로부터 철분을 흡수합니다. 시데로포어는 철을 세포 외에서 킬레이트화하고, 생성된 철-시데로포어 복합체는 세포로 활발하게 다시 운반된다3.
녹농균(P. aeruginosa )은 피오베르딘(pyoverdine)과 피오슐린(pyochelin)이라는 두 개의 사이드로포어(siderophores)를 생성하는 것으로 알려져 있습니다. 피오베르딘은 철분 킬레이트 친화도가 더 높은 것으로 알려져 있는 반면(1:1), 파이오쉐린은 철분 킬레이트 친화도가 더 낮은 것으로 알려져 있습니다(2:1)4. Pyochelin은 철분 킬레이트 친화도가 낮기 때문에 2차 사이드로포어(siderophore)라고도 불린다5. siderophore의 생산 및 조절은 녹농균6의 QS(Quorum Sensing) 시스템에 의해 능동적으로 제어됩니다.
철 담금질 외에도 siderophore는 독성 인자를 조절하는 데 관여하며 생물막 형성에 적극적인 역할을 합니다7. Siderophores는 세포 신호 전달에 관여하고, 산화 스트레스에 대한 방어, 미생물 군집 간의 상호 작용 촉진 등 추가로 중요한 역할을 합니다8. Siderophores는 일반적으로 철을 킬레이트화하는 특정 작용기에 따라 분류됩니다. 이 분류에서 세 가지 주요 bidentate 리간드는 catecholate, hydroxamate 및 α-hydroxycarboxylate3입니다. Pyoverdines는 녹농균(P. aeruginosa) 및 P. 형광(P. fluorescens)과 같은 형광 슈도모나스(Pseudomonas) 종의 특징이다 5. 이들은 6-12개의 아미노산을 함유하는 올리고펩타이드에 결합된 혼합된 녹색 형광 발색단으로 구성됩니다. 여러 가지 비리보솜 펩타이드 합성효소(NRP)가 합성에 관여한다9. 피오버다인 생산 및 조절에 관여하는 4가지 유전자는 pvdL, pvdI, pvdJ 및 pvdD10입니다. 피오베르딘은 또한 포유류의 감염과 독성을 담당한다11. 녹농균(P. aeruginosa)은 적당한 철분 제한 조건에서 피오슐린을 생성하는 것으로 알려져 있으며, 피오베르딘은 철분 제한 환경이 심한 환경에서 생성된다12. 피오쉐린 생산에 관여하는 두 개의 오페론은 pchDCBA와 pchEFGHI13입니다. 피오시아닌이 존재할 때, 피오첼린(카테콜레이트)은 산화적 손상과 염증을 유발하고 숙주 조직에 해로운 하이드록실 라디칼을 생성한다는 것이 주목된다11.
Chrome Azurol Sulfonate(CAS) 분석은 민감하지만 지나치게 특이적일 수 있는 미생물 분석에 비해 포괄성, 고감도 및 더 큰 편의성으로 인해 널리 채택되고 있습니다14. CAS 분석은 한천 표면 또는 용액에서 수행할 수 있습니다. 그것은 철 이온이 강렬한 파란색 복합체에서 주황색으로 전이될 때 발생하는 색상 변화에 의존합니다. CAS 비색 분석은 Fe-CAS-계면활성제 삼원 복합체에서 철의 고갈을 정량화합니다. 금속, 유기 염료 및 계면활성제로 구성된 이 특정 복합체는 파란색을 띠며 630nm에서 흡수 피크를 나타냅니다.
이 보고서는 한천 플레이트에서 시데로포어 생산을 감지할 수 있는 시데로포어 생산의 정성적 검출 방법을 제시합니다. 마이크로타이터 플레이트에서 총 사이드로포어 생산의 정량적 추정 방법과 녹농균(P. aeruginosa)의 두 가지 사이드로포어(pyoverdine)와 피오쉐린(pyochelin)의 검출 및 정량 분석도 제공됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar Agar, Type I</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>GRM666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Hydroxyquinoline</td>
			<td>Loba Chemie</td>
			<td>4151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino Acid</td>
			<td>SRL Chemicals</td>
			<td>68806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>RM4867-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1070242521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chrome azurol sulfonate</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>RM336-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric chloride hexahydrate</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>GRM6353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Flasks</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>5100021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Test-tubes</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>9820U05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>SDFCL</td>
			<td>20125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>King&#39;s medium B base</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>M1544-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Minimal Medium Salts</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>G013-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulphate&#160;</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>10034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiskanGO UV Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51119200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Type I, Bacteriological</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>RM667-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES free acid</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1048731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose peptone</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>RM005-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>2072310058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Laborzentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3-18K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>15915</td>
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qualitative and quantitative analysis of siderophore production from pseudomonas aeruginosa

녹농균(Pseudomonas aeruginosa , P. aeruginosa)은 숙주에 감염을 일으키기 위해 다양한 독성 인자를 생성하는 것으로 알려져 있습니다. 그러한 메커니즘 중 하나는 siderophore 생산을 통한 철의 청소입니다. 녹농균(P. aeruginosa)은 철분 킬레이트 친화도가 낮은 피오쉐린(pyochelin)과 철 킬레이트 친화도가 높은 피오베르딘(pyoverdine)의 두 가지 다른 siderophores를 생성합니다. 이 보고서는 피오베르딘은 박테리아 상층액에서 직접 정량화할 수 있는 반면, 피오쉐린은 정량화 전에 상층액에서 추출해야 함을 보여줍니다.
사이드로포어 생산을 정성적으로 분석하기 위한 기본 방법은 CAS(Chrome Azurol Sulfonate) 한천 플레이트 분석입니다. 이 분석에서 Fe3+-Dye 복합체에서 CAS 염료가 방출되면 파란색에서 주황색으로 색상이 변경되어 siderophore 생성을 나타냅니다. 총 siderophore의 정량화를 위해 박테리아 상층액을 마이크로타이터 플레이트에서 CAS 염료와 동일한 비율로 혼합한 후 630nm에서 분광광도계 분석을 수행했습니다. Pyoverdine은 50mM Tris-HCl과 동일한 비율로 혼합하여 박테리아 상청액에서 직접 정량화 한 후 분광 광도 분석을 수행했습니다. 380nm에서의 피크는 pyoverdine의 존재를 확인했습니다. Pyochelin의 경우 박테리아 상청액에서 직접 정량화할 수 없었기 때문에 먼저 추출해야 했습니다. 후속 분광 광도계 분석은 313nm에서 피크를 가진 pyochelin의 존재를 밝혀 냈습니다.

Organisms require iron to perform various vital functions, such as electron transport and DNA replication1. Pseudomonas aeruginosa, a Gram-negative opportunistic pathogen, is known to possess a variety of virulence factors to establish infection in the host, among which one mechanism is siderophore formation2. During iron-depleting conditions, P. aeruginosa releases specialized molecules called siderophores, which quench iron from the surrounding environment. Siderophores chelate iron extracellularly, and the resulting ferric-siderophore complex is actively transported back to the cell3.
P. aeruginosa is known to produce two siderophores, pyoverdine and pyochelin. Pyoverdine is known to have a higher iron chelating affinity (1:1), whereas pyochelin is known to have a lesser iron chelating affinity (2:1)4. Pyochelin is also called a secondary siderophore because it has a lower iron chelating affinity5. The production and regulation of siderophores are actively controlled by Quorum Sensing (QS) systems in P. aeruginosa6.
Besides iron quenching, siderophores are also involved in regulating virulence factors and play an active role in biofilm formation7. Siderophores serve additional crucial roles, including involvement in cell signaling, defense against oxidative stress, and facilitation of interactions between microbial communities8. Siderophores are typically categorized based on the specific functional groups through which they chelate iron. The three primary bidentate ligands in this classification are catecholate, hydroxamate, and &#945;-hydroxycarboxylate3. Pyoverdines are hallmarks of fluorescent Pseudomonas species such as P. aeruginosa and P. fluorescens5. They consist of a mixed green fluorescent chromophore coupled to an oligopeptide containing 6-12 amino acids. Several non-ribosomal peptide synthetases (NRPs) are involved in their synthesis9. Four genes involved in pyoverdine production and regulation are pvdL, pvdI, pvdJ, and pvdD10. Pyoverdine is also responsible for infection and virulence in mammals11. P. aeruginosa is noted to produce pyochelin in moderate iron-limiting conditions, while pyoverdine is produced during severe iron-limiting environments12. Two operons involved in pyochelin production are pchDCBA and pchEFGHI13. It is noted that in the presence of pyocyanin, pyochelin (catecholate) induces oxidative damage and inflammation and generates hydroxyl radicals, which are harmful to host tissues11.
The Chrome Azurol Sulfonate (CAS) assay is widely adopted due to its comprehensiveness, high sensitivity, and greater convenience compared to microbiological assays, which, although sensitive, can be overly specific14. The CAS assay can be conducted on agar surfaces or in a solution. It relies on the color change that occurs when the ferric ion transitions from its intense blue complex to orange. The CAS colorimetric assay quantifies the depletion of iron from a Fe-CAS-surfactant ternary complex. This particular complex, consisting of metal, organic dye, and surfactant, has a blue color and exhibits an absorption peak at 630 nm.
This report presents a method for the qualitative detection of siderophore production, where one can detect the production of siderophores on an agar plate. A method for the quantitative estimation of total siderophore production in a microtiter plate and the detection and quantitative analysis of two siderophores, pyoverdine and pyochelin, from P. aeruginosa, is also provided.

저자 스포트라이트: 감염 통제를 위한 Siderophores 및 Pyochelin 정량화 

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 Siderophore 생산에 대한 정성적 및 정량적 분석

Siderophores form complexes with iron and transport it into the cell during iron-limiting conditions. Siderophores are potent virulence factors which help in establishing severe infection in the host, and are known to play a role in regulating quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa. Our research aims to quantitatively estimate siderophore production in Pseudomonas.Siderophores are extracellular molecules, so total siderophores, along with pyoverdine and pyochelin are quantified using cell-free supernatant. As pyochelin is not detected in small volume, extraction is performed from a large volume of cell-free supernatant. Recently, LCMS and biosensors have been developed for quantification of pyochelin.LCMS is a costly setup for small laboratories, whereas biosensors are capable of quantification of pyochelin only. This simple and illustrated protocol uses minimum laboratory reagents and instrumentation, and allows siderophore's estimation from cell-free supernatant using less time.

임상 분리물에서 시데로포어를 정량화하기 전에, 시데로포어 생산을 보장하기 위해 시데로포어 생산에 대한 정성적 스크리닝을 수행했습니다. 임상 분리물에서 siderophore의 정성적 검출은 CAS 한천 플레이트의 줄무늬 박테리아에 의해 관찰되었습니다. 연구를 위해 MR1, TL7, J3, PAO1(참조 균주)과 함께 3개의 임상 분리물이 선택되었습니다. 세 가지 임상 분리물과 PAO1 모두 사이...

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이 프로토콜은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 총 siderophores, pyoverdine 및 pyochelin에 대한 정성적 및 정량적 분석을 모두 제공합니다.

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is known for its production of a diverse range of virulence factors to establish infections in the host. One such ...

Siderophores는 철과 복합체를 형성하고 철 제한 조건 동안 세포로 운반합니다. Siderophores는 숙주에서 심각한 감염을 확립하는 데 도움이 되는 강력한 독성 인자이며 녹농균의 정족수 감지를 조절하는 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 우리의 연구는 슈도모나스(Pseudomonas)의 사이드로포어 생산을 정량적으로 추정하는 것을 목표로 합니다.Siderophore는 세포 외 분자이므로 pyoverdine 및 pyochelin과 함께 총 siderophore는 cell-free 상층액을 사용하여 정량화됩니다. 피오쉐린은 소량으로 검출되지 않기 때문에 많은 양의 cell-free 상층액에서 추출합니다. 최근에는 피오쉐린의 정량화를 위해 LCMS와 바이오센서가 개발되고 있습니다.LCMS는 소규모 실험실을 위한 비용이 많이 드는 설정인 반면, 바이오센서는 파이오쉐린만 정량화할 수 있습니다. 이 간단한 예시 프로토콜은 최소한의 실험실 시약과 기기를 사용하며 더 적은 시간을 사용하여 cell-free 상층액에서 siderophore를 추정할 수 있습니다.

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Research

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Biology

Qualitative and Quantitative Analysis of Siderophore Production from Pseudomonas aeruginosa

2.8K 조회수.  The Maharaja Sayajirao University of Baroda. Siderophores는 철과 복합체를 형성하고 철 제한 조건 동안 세포로 운반합니다. Siderophores는 숙주에서 심각한 감염을 확립하는 데 도움이 되는 강력한 독성 인자이며 녹농균의 정족수 감지를 조절하는 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 우리의 연구는 슈도모나스(Pseudomonas)의 사이드로포어 생산을 정량적으로 추정하는 것을 목표로 합니다.Siderophore는 세포 외 분자이므로 ...

비디오: 저자 스포트라이트: 감염 통제를 위한 Siderophores 및 Pyochelin 정량화 

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is known for its production of a diverse range of virulence factors to establish infections in the host. One such mechanism is the scavenging of iron through siderophore production. P. aeruginosa produces two different siderophores: pyochelin, which has lower iron-chelating affinity, and pyoverdine, which has higher iron-chelating affinity. This report demonstrates that pyoverdine can be directly quantified from bacterial supernatants, while pyochelin needs to be extracted from supernatants before quantification.
The primary method for qualitatively analyzing siderophore production is the Chrome Azurol Sulfonate (CAS) agar plate assay. In this assay, the release of CAS dye from the Fe3+-Dye complex leads to a color change from blue to orange, indicating siderophore production. For the quantification of total siderophores, bacterial supernatants were mixed in equal proportions with CAS dye in a microtiter plate, followed by spectrophotometric analysis at 630 nm. Pyoverdine was directly quantified from the bacterial supernatant by mixing it in equal proportions with 50 mM Tris-HCl, followed by spectrophotometric analysis. A peak at 380 nm confirmed the presence of pyoverdine. As for Pyochelin, direct quantification from the bacterial supernatant was not possible, so it had to be extracted first. Subsequent spectrophotometric analysis revealed the presence of pyochelin, with a peak at 313 nm.

This protocol provides both qualitative and quantitative analyses of total siderophores, pyoverdine, and pyochelin from Pseudomonas aeruginosa.