Para começar, use uma espátula pré-resfriada para adicionar 100 miligramas de pó de tecido vegetal em um tubo de microcentrífuga de polipropileno em camadas. Em seguida, adicione imediatamente um mililitro de 20% de metanol ao tubo. Coloque o tubo tampado em um agitador por três horas em temperatura ambiente.
Em seguida, centrifugue o tubo a 9.464 G por 10 minutos e colete o sobrenadante em um frasco para injetáveis de amostrador automático LC-MS. Configure um instrumento LC-MS com uma fonte de ionização por eletrospray e uma coluna de HPLC de fase reversa. Para HPLC, use ácido fórmico a 0,1% em água como solvente A e ácido fórmico a 0,1% em acetonitrila como solvente B. Ajuste a temperatura do forno de coluna para 45 graus Celsius e a vazão para 0,5 mililitros por minuto.
Equilibre a coluna com 99% A e 1% B. Configure um gradiente de 30 minutos para que a concentração de solvente B aumente de 1% para 50% em 26 minutos, depois retorne rapidamente a 1% B em 26,01 minutos e segure por quatro minutos. Configure os parâmetros operacionais do espectrômetro de massa.
Defina a tensão de interface para quatro quilovolts, o fluxo de gás de nebulização para três litros por minuto e o fluxo de gás de aquecimento para 10 litros por minuto. Ajuste a temperatura da linha de dessolvatação para 250 graus Celsius, a temperatura do bloco de calor para 400 graus Celsius e a temperatura da interface para 300 graus Celsius. Defina o fluxo de gás de secagem para 10 litros por minuto e a pressão do gás de dissociação induzida por colisão para 17 quilopascais.
Construa um método MS no modo positivo da fonte de ionização por eletrospray, inclua varreduras Q3 e Q1 cobrindo a faixa de massa de 100 a 1.000 daltons com a varredura Q1 servindo como um evento de pesquisa com exclusão automática de isótopos. Adicione um link de varredura de íons do produto à varredura Q1 com uma janela de massa de 50 a 1.000 daltons, energia da célula de colisão de menos 20 volts e um tempo de evento de menos de 0,2 segundos. Em seguida, ajuste o método MS para adicionar varreduras de íons precursores de modo positivo iguais ao comprimento do método LC com energias de célula de colisão de menos 20 volts e tempos de evento de 0,75 segundos.
Certifique-se de que, em todos os casos, as funções automáticas de exclusão ou desisolotopação de isótopos estejam habilitadas. Defina os valores de carga mestre para fragmentos de alcalóides tropanos monossubstituídos, dissubstituídos e trissubstituídos. Em seguida, ao método MS-MS, adicione varreduras de perda neutra de modo positivo iguais ao comprimento do método LC com energias de célula de colisão de menos 20 volts e tempos de evento de 0,75 segundos.
Certifique-se de que, em todos os casos, as funções automáticas de exclusão isotópica ou desisotopação estejam habilitadas. Configure as massas de perda neutra de interesse para ésteres em alcalóides tropanos para ésteres derivados de ácido tiglic, grupos acetil e ésteres fenillácticos ou de ácido trópico. Baixe o método LC-MS e crie arquivos de dados para as amostras de interesse.
Quando a coluna de HPLC estiver equilibrada a 45 graus Celsius, injete 10 a 20 microlitros de amostra.
