Para começar, a semente dividiu nossas células T HEK293 transfectadas em uma placa de 96 poços revestida com poli-D-lisina. Em seguida, prepare três soluções frescas de Rhosin, Ehop-016 e ZCL278 em uma Microfuga II de 1,7 mililitro. Para fazer soluções de ZCL278 de 0,55 e 50 micromolares, realize diluições seriadas usando o ZCL278 micromolar inicial de 50 em meios de cultura.
Em seguida, remova o meio de cada poço da placa de 96 poços contendo células transfectadas. Adicione 50 microlitros da mistura de meios químicos e substratos a cada poço. Depois de incubar as células por uma hora, duas horas ou cinco horas, carregue a placa no leitor de placas de luminescência e meça a luminescência.
Certifique-se de que o leitor de placas esteja ligado antes de iniciar. Acesse o software Microplate Reader e clique em nova sessão para criar um novo file. Clique na incubadora para definir a temperatura do leitor de placas para 37 graus Celsius.
Marque a opção de temperatura e digite 37 graus Celsius. Em layout da placa, escolha a opção desconhecido e clique e arraste o poço para especificar os poços a serem medidos. Em seguida, vá para o protocolo, clique em luminescência e mantenha as configurações padrão.
Quando a configuração estiver concluída, carregue a placa com a tampa no leitor de placas e escolha a placa de passagem para dentro. Clique em iniciar e uma janela salvar arquivo aparecerá. Renomeie o arquivo e clique em salvar.
Quando a leitura estiver concluída, remova a placa do leitor de placas e clique na opção Run Plate In para colocar o leitor de volta. Depois de concluído, coloque a placa de volta na incubadora umidificada até a próxima leitura. Em uma, duas e cinco horas de tratamento, as células tratadas com Rhosin não mostraram alterações significativas na atividade da luciferase em comparação com as células tratadas com DMSO controle.
O inibidor de Rac GTPase EHop-016 mostrou atividade de luciferase significativamente menor do que o DMSO. As células tratadas com ZCL278 tiveram atividade de luciferase significativamente menor do que o DMSO de controle em todos os três momentos. As atividades da luciferase medidas em uma, duas e cinco horas após o tratamento mostraram uma resposta dose-dependente.
Concentrações mais altas de ZCL278 ainda apresentaram alterações significativas em comparação com o DMSO controle.
