Para começar, prepare blocos de cera de camundongos sacrificados injetados com pílulas Xiaoyao. Corte os blocos de cera em seções contínuas de seis micrômetros de espessura e asse as fatias a 70 a 72 graus Celsius por 30 a 60 minutos. Transfira as fatias para a solução de desparafinação por oito minutos, depois desidrate duas vezes em etanol anidro a 75% por cinco minutos cada antes de enxaguar em PBS por cinco minutos.
Agora execute o reparo de alta pressão EDTA por 15 minutos. Após enxaguar com PBS, adicione 3% de peróxido de hidrogênio ao tecido e incube por 10 minutos. Lave o lenço três vezes com PBS por cinco minutos cada.
Usando uma caneta de imuno-histoquímica, desenhe um círculo ao redor do tecido. Depois de lavar o tecido com PBS, corar durante a noite em solução primária de anticorpo. No dia seguinte, enxágue o lenço três vezes por cinco minutos cada em PBS.
Adicione o anticorpo secundário e incube por 60 minutos. Após enxaguar com PBS, incubar o tecido em solução DAB pronta a usar durante três a cinco minutos. Agora core o tecido com hematoxilina por três minutos.
Novamente, enxágue o tecido com PBS antes de colocá-lo em solução de diferenciação por 10 segundos. Após o enxágue do PBS, adicione a solução de retorno por 10 segundos. Por fim, execute o tratamento com etanol anidro a 75% por cinco minutos e sele a lâmina com resina neutra.
A coloração de hematoxilina-eosina mostrou trabéculas bem dispostas em camundongos simulados, enquanto os camundongos OVX exibiram alterações osteoporóticas típicas com trabéculas esparsas e cavidades medulares aumentadas. A comparação de micro CT mostrou malha trabecular incompleta e afinamento do córtex ósseo em camundongos OVX em comparação com camundongos simulados. Após a intervenção medicamentosa, a coloração de hematoxilina-eosina mostrou estrutura de trabéculas restaurada e cavidade medular reduzida em comparação com o grupo OVX.
Os índices de imagem mostraram menos trabéculas fraturadas e reticulação restaurada no grupo de pílulas Xiaoyao de alta dose em comparação com o grupo OVX. Os resultados da imuno-histoquímica mostraram aumento da fosfatase alcalina e do colágeno tipo um e diminuição da interleucina 17, ACT1 e interleucina 6 no grupo da droga.
