O saco endolinfático é necessário para o desenvolvimento normal do ouvido interno. Por ser inacessível in situ para estudos estruturais, fisiológicos e moleculares, sua dissecção de modelos animais, especialmente modelos de camundongos, é essencial. A dissecção e o preparo do saco endolinfático são extremamente difíceis devido à sua estrutura epitelial fina e delicada e à sua proximidade e aderência aos tecidos adjacentes.
Nossa abordagem facilita a visualização e identificação de um saco e sua separação dos tecidos adjacentes. Doenças e distúrbios que afetam a função normal do saco endolinfático podem levar à perda de audição e equilíbrio. Nossa técnica é essencial para elucidar os processos celulares, moleculares e fisiológicos subjacentes às funções do saco endolinfático.
Demonstrando o procedimento estará Hyun Jae Lee, um pesquisador visitante de pós-doutorado do meu laboratório. Comece organizando a preparação da orelha interna em uma placa de cultura de tecidos de 35 milímetros contendo PBS com a raiz do oitavo nervo craniano voltada para cima. Usando uma pinça nº 4, segure o tecido na cóclea e identifique o aqueduto vestibular, os canais semicirculares anterior e posterior, a cruz comum e o seio sigmóide.
Em seguida, use uma agulha de calibre 27 montada em uma seringa de um mililitro para incisar a dura-máter e o aqueduto vestibular, bem como os tecidos conjuntivos subjacentes ao redor do saco endolinfático. Depois de fazer uma incisão no tecido conjuntivo lateral ao saco endolinfático, use uma pinça para segurar o tecido conjuntivo e retire-o puxando-o para longe do osso temporal. Remova cuidadosamente quaisquer detritos restantes e separe o epitélio do saco endolinfático dos tecidos circundantes.
Para a dissecção do saco endolinfático aberto, segure a parte do caule da preparação para observar a seção transversal do lúmen. Em seguida, insira uma agulha de calibre 27 no lúmen e mova-a para cortar o saco endolinfático em duas folhas. Segure a borda de cada tecido em forma de folha com uma pinça e separe-os uns dos outros.
Na análise representativa, uma seção sagital média do crânio desses camundongos antes e depois da remoção do meio encéfalo foi visualizada com fluorescência tdTomato. O saco endolinfático era facilmente visível mesmo sem dissecção. As orelhas internas de camundongos no dia embrionário 16.6, bem como no dia pós-natal 5 e 30 foram isoladas.
Os sacos endolinfáticos foram observados sob maior magnificação. Para camundongos P30, o ducto endolinfático é difícil de isolar devido ao seu encapsulamento no osso. A imuno-histoquímica dos sacos endolinfáticos íntegros de E16.5 e P5 foi estudada com anticorpo anti-SLC26A4 e marcação com faloidina.
A faloidina foi usada para destacar o saco endolinfático e o tecido conjuntivo ao seu redor. Imagens de alta ampliação do epitélio do saco endolinfático aberto em P5 mostram que o SLC26A4 marcado em verde está localizado na região apical de um subconjunto de células. A coisa mais importante a lembrar ao tentar este procedimento é ser muito gentil para evitar danificar o saco endolinfático.
Um tecido de saco endolinfático fixo isolado por esta abordagem pode ser usado para hibridização in situ, escopo de RNA e imuno-histoquímica. O tecido vivo pode ser usado para preparar RNA para análise de transcriptoma e fisiologia. Essa abordagem tem sido usada para estudar o transcriptoma do saco endolinfático, seja como um todo ou em análise de RNA-seq de célula única para contribuir para a caracterização de seus diferentes tipos de células.
