As propriedades biomecânicas das células e tecidos regulam sua função e vitalidade. A AFM permite a quantificação precoce da osteoartrite no nível celular com base em medidas de elasticidade. A AFM permite a aquisição de medições a nível celular sem danificar a amostra e com alta resolução, confiabilidade e sensibilidade.
Mudanças na propriedade biomecânica ocorrem no início da osteoartrite. Medir a elasticidade local da cartilagem articular permite que conclusões válidas sejam tiradas sobre o grau de degeneração do tecido local. Para avaliar as alterações degenerativas dentro da articulação do joelho humano, primeiro use um bisturi para cortar a cartilagem articular como um todo do osso subcondral e incorporar a amostra de cartilagem em meio de incorporação solúvel em água no botão Cryotome que congela sob baixa temperatura no dispositivo Cryotome.
Quando a amostra estiver congelada, use um Cryotome padrão para adquirir uma parte de 35 micrômetros de espessura de tecido a partir da camada superior da cartilagem articular, coletando cada seção em lâminas de vidro individuais. Quando todas as seções tiverem sido obtidas, enxágue as amostras três vezes em PBS fresco por cinco minutos por lavagem para remover o meio de incorporação solúvel em água. Remova o primeiro slide da lavagem.
Depois disso, adicione duas a três gotas de cola de amostra biocompatível por seção em placas de Petri compatíveis com AFM individuais. Remova qualquer solução em excesso da amostra e pressione suavemente as bordas da seção seca sobre as manchas de cola. Após dois minutos, cubra cuidadosamente os tecidos ligados com o meio L-15 de Leibovitz sem L-glutamina e coloque os pratos em uma incubadora de cultura celular até que as amostras sejam analisadas.
Para preparar o dispositivo AFM, ajuste um bloco de gás para medir em um ambiente líquido no suporte AFM para que a superfície superior seja paralela ao suporte, e use pinças para montar cuidadosamente o cantilever selecionado na superfície do bloco de vidro para que a ponta AFM com a microesfera se projete sobre o plano óptico polido. Para estabilizar a cantilever no bloco de vidro, deslize a mola metálica para a ranhura do bloco e use pinças para fixar a parte superior do cantilever com a mola. Coloque cuidadosamente o bloco de vidro com a cantilever na cabeça AFM e fixe o bloco com o mecanismo de bloqueio integrado.
Em seguida, monte a cabeça AFM com a cantilever sobre o dispositivo AFM com a mola voltada para a esquerda. Para montar a amostra no dispositivo AFM, coloque a placa de Petri na amostra do suporte de amostras AFM e coloque o aquecedor da placa de Petri a 37 graus Celsius. Após cerca de 20 minutos, abra o software do dispositivo e o alinhamento a laser e a aproximação do parâmetro de configuração das janelas.
Em seguida, ligue o motor do estepe, a luz laser e a câmera CCD e use a função do motor do estepe para baixar o cantilever em 100 passos de micrômetro até que o cantilever esteja totalmente submerso no meio. Use os parafusos de ajuste para direcionar o laser em cima do cantilever e use os parafusos do dispositivo AFM para ajustar o raio laser para que o feixe refletido caia sobre o centro do fotodetetor. Uma vez que o cantilever laser tenha sido ajustado, ajuste o fotodetetor conforme necessário para definir o sinal de soma para um volt ou superior e as deflexões laterais e verticais para perto de zero.
Para obter a curva de força de calibração, execute uma abordagem do scanner com os parâmetros de aproximação indicados na tabela. Uma vez que a parte inferior do prato de cultura tecidual é atingido, retraia o cantilever por 100 micrômetros. Configure os parâmetros de execução conforme indicado na tabela.
E clique em executar para iniciar uma medição e obter uma curva de distância de força de calibração. A curva de força é obtida como ilustrada na figura. Na curva de distância da força de calibração, selecione a região para um ajuste linear da curva retraída.
Uma vez que o ajuste linear esteja no lugar, os valores serão salvos pelo software. Em seguida, como as medidas são realizadas em média a 37 graus Celsius temperatura, definir a variável de temperatura no software para 37 graus para imitar as condições fisiológicas o mais próximo possível. Para identificar os padrões conversite nas seções da amostra de cartilagem, localize e identifique os padrões celulares específicos da cartilagem articular do joelho osteoartriético no microscópio de contraste de fase, que podem incluir cordas únicas indicativas de áreas de tecido saudável, cordas duplas indicativas do início da degeneração tecidual, pequenos aglomerados, que são sinais de degeneração avançada do tecido, e grandes aglomerados, indicativo de destruição do tecido em estágio final.
Uma vez identificado um padrão específico desejado, para medições da matriz pericelular, posicione o cantilever próximo às células e meça dois locais por padrão escolhido por tipo de matriz, nove vezes por local de medição, incluindo um tamanho amostral grande o suficiente para explicar possíveis imprecisões. Concentre-se na matriz celular do padrão a ser medido e fixe o mouse do computador nesse ponto. Em seguida, concentre-se na sonda e mova a ponta da sonda para o ponto previamente fixado pela seta do computador.
Para realizar medições da matriz extracelular, selecione uma região sem células e realize uma abordagem seguida de uma retração para que o cantilever esteja posicionado 100 micrômetros acima do tecido. Em seguida, clique em executar para iniciar as medições, usando o parâmetro de setpoint obtido pela calibração do cantilever. Para processar os dados obtidos, abra o software de processamento de dados compatível com os dados obtidos do dispositivo AFM e selecione o modelo Hearst no software para processar as curvas de distância de força.
Defina a razão Poisson para 0,5, a forma da ponta como esférica e o raio de ponta para 12,5 micrômetros. Uma vez que todos os parâmetros tenham sido ajustados, os resultados serão ajustados e o Módulo do Jovem será calculado pelo software. Ao longo do modelo fisiopatológico de cordas a cordas duplas e de pequenos a grandes aglomerados, tanto a matriz extracelular quanto a matriz pericelular elástica moduli diminuem significativamente entre cada mudança de padrão, exceto entre cordas e cordas duplas.
Além disso, a razão da matriz extracelular-pericelular não muda significativamente, enquanto uma diminuição acentuada das diferenças absolutas de elasticidade entre as matrizes extracelular e pericelular é observada. Os valores de elasticidade dependem de várias condições, como a profundidade do recuo ou as propriedades da ponta cantilever. A AFM é, portanto, mais adequada para comparar condições diferentes dentro da mesma configuração experimental.
Como o AFM mede a elasticidade local da amostra, as seções precisam ser fixadas para permitir medições precisas e evitar danos cantilever. Para analisar melhor os processos responsáveis pelas alterações de elasticidade tecidual, a quantificação bioquímica da estrutura de proteínas de interesse pode ser realizada através de manchas ocidentais ou ELISAs.
