Este protocolo permite a produção de membros haploides mutagenizados que podem ser usados para triagem genética no axolotl. Em haploides, mesmo mutagênese de baixo nível pode produzir perda de fenótipos de função dentro das células. Esta técnica de enxerto também pode ser usada para resgatar fenótipos letais embrionários.
Este método pode ser usado para estudar a regeneração em qualquer espécie anfíbia que seja amenável à fertilização in vitro e enxerto. Antes de usar embriões haploides como doadores, recomendamos praticar e confirmar o sucesso dos enxertos entre os embriões diploides positivos e negativos. Para a preparação do doador de gameta feminino, anestesiar uma axolotl feminina RFP branca ou branca sexualmente madura para servir como doadora de gameta.
Após confirmar a falta de resposta à simulação da dor, use uma seringa de insulina calibre 30 para injetar 0,15 mililitros de gonadotropina coriônica humana na musculatura dorsal para o membro traseiro. Insira a seringa em um ângulo de 45 graus até a linha média para evitar o contato com a medula espinhal. Coloque o animal injetado na solução fresca de 40% holtfreter e transfira o axolotl para uma geladeira de 8 a 12 graus Celsius por 48 horas.
Em seguida, volte a fêmea à temperatura ambiente. Enquanto a fêmea está colocando ovos, coloque um macho totalmente anestesiado na posição supina em toalhas de papel úmido sob um microscópio dissecando e posicione a ponta de uma pipeta P1000 na base da cloaca com a mão dominante. Coloque o outro indicador e o polegar de dois a três centímetros rostral para a pelve e aperte suavemente o animal enquanto move os dedos em direção às pernas traseiras para liberar as amostras de urina espergênicas coletando cada amostra em um novo tubo de microcentrifuuge.
Em seguida, transfira cinco microlitros de cada amostra para uma placa de Petri para inspecionar a qualidade do esperma usando um microscópio invertido. Após a contagem, dilui o esperma para uma concentração de oito vezes 10 para a quarta célula por mililitro em 0,1X mmr estéril e transferir 0,5 microliters de células espermatozoides por óvulo para uma nova placa de Petri. Em seguida, use a ponta da pipeta para espalhar a suspensão para uma camada de um milímetro de espessura e use um elevador plástico para colocar a amostra a quatro centímetros das lâmpadas de um crosslinker de 254 nanômetros para irradiação em oito vezes 10 para o quinto microjoules por milímetro quadrado.
Depois de coletar uma amostra saudável de esperma, coloque a fêmea na posição supina em uma pilha de toalhas de papel úmidas e use um movimento de descarga semelhante para extrair óvulos não fertilizados da axolotl fêmea. Em seguida, use fórceps molhados para transferir os ovos para uma placa de Petri de 10 centímetros. Dentro de 15 minutos após a coleta, use uma pipeta P10 para distribuir o esperma irradiado sobre os óvulos não fertilizados que cobrem cada óvulo com 0,25 a 0,5 microliters de esperma inativado.
Depois de permitir que os ovos fiquem em temperatura ambiente por 30 minutos, inunde os ovos com 0,1X MMR. Trinta minutos após a hidratação, use fórceps afiados para desapropriar os ovos e coloque os ovos a 18 graus Celsius para microinjeção dentro de sete horas. Para gerar uma quimera haploide-diploide, coloque um doador haploide saudável com um ou dois estágios combinados GFP embriões diploides diploides positivos dentro do cocho de um prato operacional pré-refrigerado contendo meio cirúrgico em um estágio de resfriamento de 10 graus Celsius ou inferior.
Use duas fórceps de ponta reta autoclavadas ultra finas para remover todo o botão do membro e as camadas de tecido ectoderm circundante e mesoderm e reserve o tecido hospedeiro. Remova uma baia de tecido de tamanho equivalente do doador de haploide e coloque a baia de tecido do doador haploide na região correspondente do embrião hospedeiro. Fixar o tecido com um fragmento de vidro retangular autoclaved de um vidro de microscópio esmagado e pressione suavemente o tecido no corpo do embrião hospedeiro.
Deixe a âncora no lugar por 60 a 75 minutos verificando a cada 20 minutos para confirmar que o vidro não escorregou antes de usar as fórceps para retirar o fragmento da tampa. Transfira os embriões engrafados para um meio cirúrgico fresco, permitindo que eles se curem a 8 a 12 graus Celsius durante a noite antes de abrigar os embriões engrafados individualmente em placas de 12 ou 24 poços. 38,7% dos oócitos desenvolveram-se em embriões haploides normalmente desenvolvidos.
Na fase de enxerto, os embriões haploides exibem uma curvatura reduzida ao longo do eixo anterior-posterior e um gabinete incompleto do plugue de gema. Além disso, um microscópio fluorescente pode ser usado para confirmar que os embriões haploides estão livres da expressão GFP derivada paternamente. Enxertos impuros e falhos produzem uma variedade de fenótipos.
Quando os enxertos são limpos e normalmente desenvolvidos, a expressão GFP deve ser limitada principalmente ao plexo braquial, a rede neural derivada da medula espinhal hospedeira. A expressão de GFP pontual também está presente em células únicas que parecem ser neurônios sensoriais em células hospedeiras derivadas do sangue que migram para o membro em desenvolvimento. Quando os doadores positivos de RFP são usados, os membros do enxerto haploide exibem uma expressão universal de RFP.
Durante todo o desenvolvimento, membros haploides não mutagenizados são significativamente mais curtos do que os membros dianteiros diploides opostos em animais quiméricos. Membros haploides não mutagenizados se regeneram totalmente, embora demonstrem um pequeno atraso em alcançar o estágio de crescimento digital em comparação com os diploides. Lembre-se de usar técnica estéril e remova e substitua completamente as camadas completas de tecido de mesoderm e ectoderm do hospedeiro embrionário, a fim de produzir um membro limpo mente enxertado.
Membros mutantes podem ser amputados e pontuados para fenótipos de regeneração. Alelos mutantes podem ser quantificados com sequenciamento de próxima geração. Combinada com mutagênese CRISPR-Cas9, nossa técnica de enxerto nos permitiu conduzir uma tela de seleção negativa de genes-alvo na regeneração de membros haploides.
