Este método adapta o protocolo de cultura metatarsal a ossos maiores, permitindo que a manipulação óssea direta seja combinada com modelos genéticos complexos para abordar processos relacionados ao desenvolvimento ósseo. Essa técnica permite a manipulação e análise do crescimento ósseo que não são possíveis in vivo, como imagem viva ou manipulação física direta e farmacológica. Este método de cultura ex vivo permite o estudo específico dos efeitos locais do inset genético no osso que o separa do efeito sistêmico que o tratamento tem sobre o organismo.
Comece esterilizando a região abdominal de um dia gestacional gestante de 14,5 a 18,5 camundongos com 80% de etanol e usando uma tesoura pequena para abrir a pele e os músculos abdominais para acessar os chifres uterinos. Para extrair o útero da cavidade abdominal, remova o mesometrium e corte a base dos chifres. Em seguida, transfira o útero para uma placa de petri de 60 milímetros contendo meio de dissecção gelada no gelo.
Em um armário de biossegurança cortado entre os sacos com tesouras para separar os fetos individuais, e transferir um saco individual para um novo prato de 60 milímetros com meio de dissecção fresco sob um microscópio estereo de dissecção. Use pinças para separar os fetos das placentas e limpar os fetos das membranas. Use uma pipeta de plástico aparada para transferir o corpo para um novo prato de 60 milímetros, e decapitule o embrião antes de uma dissecção adicional.
Em seguida, use pinças para remover a pele, começando pelas costas e descascando para os dedos dos dedos. Use a pinça para cortar perto da coluna vertebral e separar os membros traseiros do corpo. Transfira os membros traseiros para um prato limpo contendo meio de dissecção gelada e insira a pinça entre a cartilagem superficial do fêmur distal e a tíbia proximal para separar a tíbia do fêmur.
Remova os ossos do quadril do fêmur proximal e do osso calcâneo e da fíbula da tíbia. Corte cuidadosamente e puxe os tecidos moles dos fêmures e tíbias e use uma pipeta estéril de um mililitro para transferir todos os quatro ossos das pernas para o primeiro poço de uma placa de 24 poços contendo meio de dissecção fresco. É importante mostrar que o tecido mole que liga o pulso do osso é removido.
Caso contrário, o osso se dobrará e não alcançará o crescimento adequado. Quando os ossos são dissecados a partir do número experimental adequado de fetos, imagem os ossos em cada poço às vezes zero sob um microscópio leve com um bom contraste e substituir o meio de dissecção em cada poço com um mililitro de cultura médio por poço tomando cuidado extra para não aspirar os ossos. Para observar o efeito da inibição do crescimento nas condições de cultura, trate as tíbias esquerdas com 500 ácidos retinóicos nanomolares e incubar as tíbias direitas com um volume equivalente de veículo como controle.
Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de cultura celular sob condições padrão de cultura celular. Após dois dias, trate os ossos com um análogo de timmidina apropriado por uma a duas horas para avaliar a proliferação celular óssea antes de transferir os ossos para tubos individuais de dois mililitros de 4% de paraformaldeído por 10 minutos. Em seguida, transfira os ossos para PBS para a imagem dos ossos no momento final antes de devolver as amostras ao paraformaldeído para fixação durante a noite a quatro graus Celsius.
Para medir o comprimento e a região mineralizada dos ossos, abra um programa de software de imagem adequado e, levando em conta a escala da imagem, meça tanto o comprimento total do osso quanto a região mineralizada. Começando as medições das primeiras células escuras em uma extremidade até as últimas células escuras na outra extremidade. Para calcular a taxa de crescimento definida como o aumento médio do comprimento por dia, divida a diferença entre o comprimento final do osso e o comprimento inicial pelo número de dias na cultura.
Aqui, uma comparação entre tíbia cultivada e tíbia recém-extraída em estágios equivalentes é mostrada. Após até dois dias de cultura, o tamanho alcançado é comparável ao crescimento ósseo in vivo tanto para a cartilagem quanto para o osso mineralizado. Períodos de cultura mais longos levam a maiores diferenças entre os ossos cultivados e ossos recém-extraídos.
Note que a tíbia cultivada com uma remoção incompleta do tecido mole pode resultar em dobra da tíbia cultivada. O tratamento com ácido retinóico tem um efeito robusto no crescimento tibial logo após dois dias de tratamento. Embora haja um aumento consistente no comprimento total da tíbia após dois dias na cultura, esse crescimento corresponde a um aumento aproximado de apenas nove a 29% do comprimento inicial.
Menos do que o aumento do crescimento ósseo que seria observado in vivo. De fato, a rotulagem analógica da timmidina mostra menos células positivas nesta região após a cultura em comparação com ossos recém-extraídos de um estágio equivalente. Além disso, na tíbia cultivada in vitro, o comprimento total do elemento esquelético aumenta substancialmente, enquanto quase nenhum aumento na região mineralizada é observado.
Além da análise histológica e molecular, o desmatamento e a imagem 3D podem ser realizados após a cultura para caracterizar o efeito celular dos tratamentos aplicados aos ossos cultivados. A técnica nos permite abordar questões relacionadas à comunicação interorganal. Por exemplo, co-esculpindo ossos dos diferentes modelos genéticos em algum tipo de experimento de parabiose sem dor.
